DNA-sekvensering: definisjon, metoder, eksempler

Nukleotider er livets kjemiske byggesteiner og finnes i DNA fra levende organismer. Hvert nukleotid består av et sukker, fosfat og en nitrogenholdig base: adenin (A), tymin (T), cytosin (C) og guanin (G). Den spesifikke rekkefølgen til disse nukleotidbasene bestemmer hvilke proteiner, enzymer og molekyler som skal syntetiseres av cellen.

Å bestemme rekkefølgen, eller sekvensen av nukleotider, er viktig for studiet av mutasjoner, evolusjon, sykdomsprogresjon, genetisk testing, rettsmedisinsk undersøkelse og medisin.

Genomikk er studiet av DNA, gener, geninteraksjoner og miljøpåvirkning på gener. Hemmeligheten bak å oppdage de komplekse indre funksjonene til gener er å kunne identifisere deres struktur og plassering på kromosomer.

Tegningen av levende organismer bestemmes av rekkefølgen (eller sekvensen) av nukleinsyrebasepar i DNA. Når DNA replikerer, pares adenin med tymin og cytosin med guanin; uforenlige par vurderes mutasjoner.

Siden den dobbelte helixen deoksyribonukleinsyre

Samtidig tillater pågående diskusjoner forskere å være i forkant av de etiske implikasjonene av slike raskt eksploderende teknologier.

DNA-sekvensering er prosessen med å oppdage sekvensen til forskjellige nukleotidbaser i DNA-utdrag. Hele gensekvensering tillater sammenligninger av kromosomer og genomer som er tilstede i samme og forskjellige arter.

Kartlegging av kromosomer er nyttig for vitenskapelig forskning. Analyserer mekanismene og strukturen til gener, alleler og kromosomale mutasjoner i DNA-molekyler antyder nye måter å behandle genetiske lidelser og stoppe kreftsvulst, f.eks.

Frederick Sangers DNA-sekvenseringsmetoder avanserte feltet genomikk fra 1970-tallet. Sanger følte seg klar til å takle DNA-sekvensering etter vellykket sekvensering av RNA når han studerte insulin. Sanger var ikke den første forskeren som dablet i DNA-sekvensering. Imidlertid tjente hans smarte DNA-sekvenseringsmetoder - utviklet sammen med kollegene Berg og Gilbert - en Nobelpris i 1980.

Sanger visste den potensielle verdien av arbeidet sitt og samarbeidet ofte med andre forskere som delte hans interesser i DNA, molekylbiologi og livsvitenskap.

Selv om det var tregt og dyrt i forhold til dagens sekvenseringsteknologier, ble Sangers DNA-sekvenseringsmetoder hyllet på den tiden. Etter prøving og feiling fant Sanger den hemmelige biokjemiske "oppskriften" for å skille DNA-tråder, skape mer DNA og identifisere rekkefølgen av nukleotider i et genom.

Materialer av høy kvalitet kan lett kjøpes for bruk i laboratoriestudier:

• DNA-polymerase er enzymet som trengs for å lage DNA.
• DNA-grunning forteller enzymet hvor du skal begynne å jobbe med DNA-strengen.
• dNTPer er organiske molekyler som består av deoksyribosesukker og nukleosidtrifosfater - dATP, dGTP, dCTP og dTTP - som samler proteiner
• Kjede-terminatorer er fargestoff nukleotider, også kalt terminator nukleotider for hver base - A, T, C og G.

Sanger fant ut hvordan man kuttet DNA i små segmenter ved hjelp av enzymet DNA-polymerase.

Deretter laget han mer DNA fra en mal og satte inn radioaktive sporstoffer i det nye DNAet for å avgrense deler av de atskilte strengene. Han anerkjente også at enzymet trengte en primer som kunne binde seg til et bestemt sted på malstrengen. I 1981 skrev Sanger igjen historie ved å finne ut genomet til mitokondrie-DNA's 16.000 basepar.

Temperaturen må justeres nøye gjennom hele sekvenseringsprosessen. Først tilsettes kjemikalier i et rør og oppvarmes for å løse opp (denaturere) dobbeltstrenget DNA-molekyl. Deretter avkjøles temperaturen, slik at primeren binder seg.

Deretter økes temperaturen for å oppmuntre til optimal DNA-polymerase (enzym) aktivitet.

Polymerase bruker vanligvis de tilgjengelige normale nukleotidene, som tilsettes i en høyere konsentrasjon. Når polymerase kommer til et "kjedeterminerende" fargestoffbundet nukleotid, stopper polymerasen, og den kjeder ender der, noe som forklarer hvorfor de fargede nukleotidene kalles "chain terminating" eller "Terminatorer."

Prosessen fortsetter mange, mange ganger. Til slutt har det fargestoffbundne nukleotidet blitt plassert i hver eneste posisjon i DNA-sekvensen. Gelelektroforese og dataprogrammer kan deretter identifisere fargestofffargene på hver av DNA-trådene og finne ut hele DNA-sekvensen basert på fargestoffet, posisjonen til fargestoffet og lengden på fargestoffet tråder.

High-throughput sekvensering - generelt referert til som neste generasjons sekvensering - bruker nye fremskritt og teknologier for å sekvensere nukleotidbaser raskere og billigere enn noen gang før. En DNA-sekvenseringsmaskin kan enkelt håndtere store DNA-strekninger. Faktisk kan hele genomene gjøres i løpet av få timer, i stedet for år med Sangers sekvenseringsteknikker.

Neste generasjons sekvenseringsmetoder kan håndtere DNA-analyse med høyt volum uten det ekstra trinnet med amplifikasjon eller kloning for å få nok DNA til sekvensering. DNA-sekvenseringsmaskiner kjører flere sekvenseringsreaksjoner samtidig, noe som er billigere og raskere.

I hovedsak kjører den nye DNA-sekvenseringsteknologien hundrevis av Sanger-reaksjoner på en liten, lett lesbar mikrochip som deretter kjøres gjennom et dataprogram som samler sekvensen.

Teknikken leser kortere DNA-fragmenter, men den er fortsatt raskere og mer effektiv enn Sangers sekvenseringsmetoder, så selv store prosjekter kan raskt fullføres.

De Human Genome Project, fullført i 2003, er en av de mest kjente sekvenseringsstudiene som er gjort hittil. I følge en artikkel fra 2018 i Science News, består det menneskelige genom av ca. 46 831 gener, som var en formidabel utfordring å sekvensere. Toppforskere fra hele verden brukte nesten 10 år på å samarbeide og konsultere. Ledet av National Human Genome Research

Institute, prosjektet kartla vellykket det menneskelige genomet ved hjelp av en sammensatt prøve hentet fra anonyme blodgivere.

Human Genome Project støttet seg på bakterielle kunstige kromosom (BAC-baserte) sekvenseringsmetoder for å kartlegge basepar. Teknikken brukte bakterier til å klone DNA-fragmenter, noe som resulterte i store mengder DNA for sekvensering. Klonene ble deretter redusert i størrelse, plassert i en sekvenseringsmaskin og samlet i strekninger som representerer humant DNA.

Nye funn i genomikk endrer tilnærminger til forebygging, påvisning og behandling av sykdommer. Regjeringen har forpliktet milliarder av dollar til DNA-forskning. Politi er avhengig av DNA-analyse for å løse saker. DNA-testsett kan kjøpes for hjemmebruk for å undersøke forfedre og identifisere genvarianter som kan utgjøre helserisiko:

• Genomisk analyse innebærer å sammenligne og kontrastere genomssekvensene til mange forskjellige arter i livets domener og riker. DNA-sekvensering kan avsløre genetiske mønstre som kaster nytt lys over når visse sekvenser ble introdusert evolusjonært. Forfedre og migrasjon kan spores via DNA-analyse og sammenlignes med historiske poster.

• Fremskritt innen medisin skjer i en eksponentiell hastighet fordi praktisk talt alle menneskers sykdommer har en genetisk komponent. DNA-sekvensering hjelper forskere og leger til å forstå hvordan flere gener samhandler med hverandre og miljøet. Rask sekvensering av DNA fra en ny mikrobe som forårsaker et sykdomsutbrudd, kan bidra til å identifisere effektive medisiner og vaksiner før problemet blir et alvorlig folkehelseproblem. Genvarianter i kreftceller og svulster kan sekvenseres og brukes til å utvikle individualiserte genterapier.

• Rettsmedisin søknader har blitt brukt for å hjelpe politiet med å knekke tusenvis av vanskelige saker siden slutten av 1980-tallet, ifølge National Institute of Justice. Bevis på åstedet kan inneholde prøver av DNA fra bein, hår eller kroppsvev som kan sammenlignes med DNA-profilen til en mistenkt for å avgjøre skyld eller uskyld. Polymerasekjedereaksjonen (PCR) er en vanlig metode for å lage kopier av DNA fra sporingsbevis før sekvensering.

• Sekvensering av nyoppdagede arter kan bidra til å identifisere hvilke andre arter som er tettest beslektede og avsløre informasjon om evolusjon Taksonomer bruker DNA “strekkoder” for å klassifisere organismer. Ifølge University of Georgia i mai 2018 er det anslagsvis 303 pattedyrarter som ennå ikke er oppdaget.

• Genetisk testing for sykdommer se etter muterte genvarianter. De fleste er enkle nukleotidpolymorfier (SNP), som betyr at bare ett nukleotid i sekvensen er endret fra den “normale” versjonen. Miljøfaktorer og livsstil påvirker hvordan og om visse gener kommer til uttrykk. Globale selskaper gjør banebrytende ny generasjon sekvenseringsteknologi tilgjengelig for forskere over hele verden som er interessert i multigen-interaksjoner og helgenomsekvensering.

• Genealogy DNA-sett bruke DNA-sekvenser i databasen for å se etter varianter i individets gener. Settet krever en spyttprøve eller kinnpinne som sendes til et kommersielt laboratorium for analyse. I tillegg til forfedreinformasjon, kan noen sett identifisere enkle nukleotidpolymorfier (SNP) eller andre kjente genetiske varianter som BRCA1 og BRCA2 gener assosiert med forhøyet risiko for kvinnelig bryst og eggstokkreft.

Ny teknologi kommer ofte med muligheten for sosial nytte, så vel som skade; eksempler inkluderer funksjonsfeil på atomkraftverk og atomødeleggelsesvåpen. DNA-teknologier har også risiko.

Følelsesmessige bekymringer om DNA-sekvensering og genredigeringsverktøy som CRISPR inkluderer frykt for at teknologi kan lette menneskelig kloning, eller føre til mutante transgene dyr opprettet av en rogue forsker.

Oftere har etiske spørsmål knyttet til DNA-sekvensering å gjøre med informert samtykke. Enkel tilgang til direkte-til-forbruker DNA-testing betyr at forbrukere kanskje ikke helt forstår hvordan deres genetiske informasjon vil bli brukt, lagret og delt. Legfolk er kanskje ikke følelsesmessig klare til å lære om deres mangelfulle genvarianter og helserisiko.

Tredjeparter som arbeidsgivere og forsikringsselskaper kan potensielt diskriminere personer som bærer defekte gener som kan gi alvorlige medisinske problemer.