Fordelene med å bruke klissete enzymer

Molekylær kloning er en vanlig bioteknologisk metode som alle studenter og forskere skal være kjent med. Molekylær kloning ved hjelp av en type enzym kalt et restriksjonsenzym for å kutte humant DNA i fragmenter som deretter kan settes inn i plasmid-DNA i en bakteriecelle. Restriksjonsenzymer kutter dobbeltstrenget DNA i to. Avhengig av begrensningsenzymet, kan kuttet resultere i enten en klebrig ende eller en stump ende. Klissete ender er mer nyttige i molekylær kloning fordi de sørger for at det humane DNA-fragmentet settes inn i plasmidet i riktig retning. Ligeringsprosessen, eller sammensmelting av DNA-fragmenter, krever mindre DNA når DNA har klebrig ender. Til slutt kan flere klebrige endebegrensningsenzymer produsere den samme klebrige enden, selv om hvert enzym gjenkjenner en annen begrensningssekvens. Dette øker sannsynligheten for at DNA-regionen din av interesse kan kuttes ut av klissete enzymer.

Restriksjonsenzymer er enzymer som kutter gjenkjenner spesifikke sekvenser på dobbeltstrenget DNA og kutter DNA i to ved den sekvensen. Den anerkjente sekvensen kalles restriksjonsstedet. Restriksjonsenzymer kalles endonukleaser fordi de kutter dobbeltstrenget DNA, slik DNA vanligvis eksisterer, på steder som er mellom endene av DNA. Det er mer enn 90 forskjellige restriksjonsenzymer. Hver gjenkjenner et tydelig begrensningsside. Restriksjonsenzymer klyver sine respektive restriksjonssider 5000 ganger mer effektivt enn andre nettsteder som de ikke kjenner igjen.

Restriksjonsenzymer kommer i to generelle klasser. De kutter enten DNA i klissete ender eller stumpe ender. En klissete ende har en kort region av nukleotider, byggesteinene til DNA, som ikke er parret. Denne uparede regionen kalles et overheng. Overhenget sies å være klissete fordi det vil og vil parres med en annen klebrig ende som har komplementær overhengssekvens. Sticky ender er som tvilte tvillinger som forsøker å klemme hverandre tett når de møtes. På den annen side er stumme ender ikke klissete fordi alle nukleotidene allerede er sammenkoblet mellom de to DNA-strengene. Fordelen med klebrig ender er at et fragment av humant DNA bare kan passe inn i et bakterieplasmid i en retning. I kontrast, hvis både det humane DNA og bakterieplasmidet har stumpe ender, kan det humane DNA settes head-to-tail eller tail-to-head i plasmidet.

Selv om DNA med pinneender har lettere for å finne hverandre på grunn av deres "klebrighet", kan hverken klebrige ender eller stumpe ender smelte sammen til et kontinuerlig stykke DNA. Dannelse av et kontinuerlig stykke DNA som er fullstendig koblet krever et enzym som kalles ligase. Ligaser kobler ryggraden til nukleotider i de klebrig eller stumpe ender, noe som resulterer i en kontinuerlig kjede av nukleotider. Fordi klebrig ender finner hverandre raskere på grunn av deres tiltrekningskraft for hverandre, krever ligeringsprosessen mindre humant DNA og mindre plasmid-DNA. De stumpe ender av DNA og plasmider er mindre sannsynlig å finne hverandre, og dermed krever ligering av stumpe ender at mer DNA blir satt i reagensrøret.

Restriksjonssider er lokalisert i hele organismenes genom, men er ikke jevnt fordelt. I plasmider kan de konstrueres for å være plassert rett ved siden av hverandre. Forskere som ønsker å kutte ut et fragment av menneskelig DNA fra det menneskelige genomet, må finne restriksjonssteder som er foran og bak i regionen av fragmentet. I tillegg til å sikre at et DNA-fragment blir satt inn i riktig retning, kan forskjellige enzymer med klebrig ende skape den samme klebrig enden selv om de gjenkjenner forskjellige restriksjonssekvenser. For eksempel har BamHI, BglII og Sau3A forskjellige gjenkjenningssekvenser, men produserer den samme klissete GATC-enden. Dette øker sannsynligheten for at det vil være klebrig endestriksjonssider som flankerer ditt menneskelige gen av interesse.