Gelelektroforese er en vanlig laboratorieteknikk med mange praktiske anvendelser, inkludert DNA-fingeravtrykk og genomsekvensering. Prosessen innebærer å skille DNA fragmenter ved hjelp av en elektrisk strøm mens du sporer molekylær bevegelseshastighet gjennom en filtreringsgel.
Hvis du legger til blå eller oransje sporingsfargestoff i fargeløse DNA-prøver, kan du se prøven din og få informasjon om hvordan DNA-molekyler beveger seg under elektroforese. Identifikasjon er basert på størrelsen på DNA-bånd på gelen etter migrering av molekyler.
Hvordan gelelektroforese fungerer
Gelelektroforese trekker DNA-fragmenter gjennom en gel ved hjelp av en elektrisk strøm for å isolere og identifisere DNA-molekyler etter størrelse og elektrisk ladning. Gelen lages ofte med agarosepulver - et polysakkarid ekstrahert fra tang.
Agarose tilsettes en bufferløsning av vann og salt, og blandingen oppvarmes og avkjøles for å lage en porøs gel som vil fungere som en filtreringsmatrise under elektroforeseprosedyren. Gelen plasseres deretter i en elektroforeseenhet og dekkes med bufferløsning som leder
elektrisitet.Løsninger som inneholder DNA og lastefargestoffer pipetteres i små brønner i gelen som må lages under gelpreparasjon. Fargestofferhjelpe degtydelig se prøven som du legger til gelbrønnene i nærheten av den negative elektroden til elektroforeseenheten.
En positiv elektrode er plassert i motsatt ende. En kjent standard for DNA-fragmenter er plassert i den første brønnen som vil skape en stige av DNA-bånd for sammenligning og identifikasjon.
Fosfatgraden i DNA-molekyler gir DNA en negativ ladning. Motsetninger tiltrekker seg, derfor blir DNA-molekyler tiltrukket av den positive elektroden og begynner å bevege seg, eller "migrere", når en elektrisk strøm slås på.
Mindre størrelse DNA-fragmenter beveger seg raskere enn større fragmenter fordi de møter mindre motstand når de vandrer gjennom gelens porøse matrise. DNA-fragmenter av lignende størrelse danner DNA-bånd i gelen.
Laster fargestoffets formål og viktighet
DNA er fargeløst, så du legger til sporing av fargestoffer til et utvalg hjelper deg bestem bevegelseshastigheten av proteinmolekyler av forskjellig størrelse i gelen under elektroforese. Eksempler på lasting av fargestoffer som beveger seg med DNA-prøven inkluderer bromfenolblå og xylencyanol.
Det valgte fargestoffet skal ikke være reaktivt eller endre DNA. Bromfenolblå er et fargestoff som brukes til å spore mindre DNA-tråder som inneholder omtrent 400 basepar, mens xylencyanol er bedre for større DNA-tråder med opptil 8000 basepar. Det valgte fargestoffet skal ikke være reaktivt eller endre DNA.
Rollen av glyserol i agarosegelelektroforese
Når du klargjør DNA-prøven din for elektroforese, må du tilsette glyserol og vann sammen med fargestoffer. Glyserol er et tungt, sirupaktig stoff som gir DNA-prøven mer tetthet før den settes inn i brønnene i den ene enden av gelarket.
Uten glyserol spredte DNA-prøven seg i stedet for å synke og danne et lag i brønnen slik den skulle gjøre for å danne en DNA-stige.
Tracking Dye i SDS PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) er en teknikk som er egnet for å skille proteiner og aminosyrer, som er mindre og mer komplekse enn lineære DNA-molekyler. Polyakrylamid (SDS PAGE gel) brukes i stedet for agarosegel for elektroforese.
Bromfenolblått (BPB) tilsettes prøvebufferen som en sporingsfargestoff som beveger seg i samme retning for å skille proteiner og avgrenser deres forkant.
Rollen til DNA-bindende fargestoff
DNA-bindende fargestoff som oransje farget etidiumbromid kan tilsettes til gel eller til elektroforesebuffer. Som navnet antyder, festes fargestoffet til DNA-molekylet.
Det må utvises stor forsiktighet når du håndterer dette mutagene fargestoffet fordi det kan binde seg til DNA i hudceller. I motsetning til sporingsfargestoffer, etidiumbromid fluorescerer lyst under UV-lys, gjør DNA-båndene synlige.