Ifølge University of Wisconsin's BioWeb-nettsted er en PCR-primer en kort, syntetisk oligonukleotid (vanligvis mellom 18 til 25 baser lange) brukt til å amplifisere spesifikke DNA-regioner i en molekylærbiologisk teknikk kjent som polymerasekjedereaksjon (PCR). Både en primer forover og bakover er nødvendig, designet for å være omvendt komplement til DNA-strengen, for å flankere og binde til ønsket DNA-region. Når forskere ønsker å utføre forskning på et spesifikt gen eller en region av DNA, må de først utføre PCR for å skaffe seg nok av målregionen å jobbe med. Å designe primersekvenser for regionen av interesse kan være nødvendig hvis de ikke allerede er tilgjengelige gjennom tidligere publisert forskning eller på kommersiell måte.
Få nukleotidsekvensen til genet eller DNA-regionen av interesse, og bestem hvor lenge et fragment du vil amplifisere. Primeren forover og bakover er designet for å binde seg i begynnelsen og slutten av ønsket fragment. Vanligvis bruker konvensjonelle PCR-metoder primere som flankerer et område mellom 100 til 1000 basepar, mens sanntids PCR-metoder bruker fragmenter som er omtrent 50 til 200 basepar lange.
Bestem hvor i sekvensen du vil at primerne skal ligge. For eksempel vil du kanskje ha stedet nær 5 'eller 3' slutten av sekvensen eller i midten. Om ønskelig, angi plasseringen til primerne for å strekke seg over et intron.
Design primere til å være 18 til 24 baser i lengde. Vincent R. Prezioso, Ph. D., fra Brinkmann Instruments Inc., antyder at denne lengden er lang nok til å være ekstremt spesifikk for ønsket DNA-region, men kort nok til å binde (annealere) lett. Primersmeltetemperaturen (Tm) bør være mellom 55 og 80 grader Celsius, lav nok til å tillate fullstendig smelting ved eller over 90 grader Celsius, men høy nok til å tillate gløding. GC-innholdet (prosentandel av Gs og Cs i sekvensen) skal være mellom 40 og 60 prosent. 3'-enden av primersekvensen bør ende i en C eller en G (kalt GC-klemme) for å fremme binding, siden G og C nukleotider har sterkere bindinger, men unngå å ha tre eller flere Gs eller Cs i de siste fem basene av sekvensen.
Unngå å ha kjøringer på fire eller flere av en base (som ACCCC ...) eller fire eller flere di-nukleotid-repetisjoner (som ATATATAT ...) fordi de kan forårsake feilpriming. Design primere uten intra-primer-homologi (mer enn tre baser som utfyller den ene primer i seg selv) eller inter-primer homologi (der primer forover og bakover har komplement sekvenser). Dette kan forårsake selvdimerer eller primer-dimerer, hvor primerne binder seg til seg selv i stedet for å binde seg til ønsket DNA-sekvens.
Bruk nettbaserte ressurser og nettsteder som hjelper deg med primerdesign eller hjelper til med å sjekke primersekvenser for selvkomplementaritet eller potensialet for å lage sekundære strukturer som hårnål. Noen primer design nettsteder inkluderer Massachusetts Institute of Technology Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast og Integrated DNA Technologies 'OligoAnalyzer.