En celles genetiske tegning er kodet i dens genetiske materiale, eller DNA. Siden DNA aldri forlater cellekjernen, for at denne informasjonen skal komme inn i cytoplasmaet der andre proteiner og biokjemiske komponenter ligger, er det nødvendig å først transkribere DNA i messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Dette mRNA blir deretter oversatt til proteiner som utfører mange funksjoner i cellen. For å oppdage eller kvantifisere svært sjeldne mRNAer, lage sonder for mikroarrays eller konstruere biblioteker med komplementære DNA-molekyler, må mRNA isoleres. Ekstraksjon av total RNA (dvs. alt RNA i en celle) og påfølgende mRNA-isolasjon er imidlertid ikke gjensidig utelukkende prosesser; førstnevnte må utføres for at mRNA skal ekstraheres.
TRIzol-homogenisering: Total RNA inkluderer alt mRNA, overførings-RNA, ribosomalt RNA og annen ikke-koding RNA. For å skille disse fra andre mobilkomponenter, sprenges cellen først for å frigjøre dens innholdet. Dette gjøres ved å resuspendere celler pelleterte ved sentrifugering (spinning ved høye hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versjoner av TRIzol (som Ambions TRI Reagent) fungerer på samme måte.
Total RNA-isolasjon: En serie sentrifugeringer brukes til å skille de forskjellige komponentene (proteiner, DNA, RNA) i cellen i lag eller faser i suspensjonen. Den øverste, gulfargede fasen består av fett og kan kastes. Den ønskede fasen er tonet rød, inneholder total RNA og beholdes. Etter å ha utført en fenol-kloroform-ekstraksjon og en serie alkoholvask ved bruk av isopropanol og etanol, kan RNA pelleteres for mRNA-isolasjon. Tilsett RNase-hemmere for å forhindre at dette enzymet forringer total RNA.
mRNA-ekstraksjon: Det er vanlig å bruke et sett for å isolere mRNA, da hjemmelagde laboratorieprotokoller ikke genererer store mengder av høyt rensede mRNAer. Kommersielle sett inkluderer Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Sett. Disse grunnleggende trinnene er felles for slike sett:
d) Sentrifuger denne prøven og gjenvinn supernatanten, som vaskes flere ganger i en serie bindings- og lavsaltbuffere gitt i settene.
Referanser
- "cDNA-biblioteksprotokoller?"; Ian G. Cowell og Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transkripsjons- og oversettelsesprotokoller?"; Martin J. Tymmer; 1995
Tips
- Hold alle reagenser, celler og RNA kaldt ved å dyppe ned i is. Dette forhindrer at RNA nedbrytes av andre enzymer som frigjøres under homogeniseringsprosessen.
Advarsler
- Reagenser som TRIzol er giftige og må ikke være i kontakt med hud eller slimhinner. Overhold alltid sikre laboratorieprotokoller når du håndterer dette reagenset.
om forfatteren
Palmer Owyoung har en Master of Arts i internasjonal virksomhet fra University of California i San Diego og en Bachelor of Arts i sosiologi fra University of California i Santa Barbara og er utdannet molekylær biolog. Han har vært frilansskribent siden 2006. I tillegg til å skrive, er han en heltidsforhandler og internettmarkedsfører på heltid.
Fotokreditter
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images