Spektrofotometri er et uvurderlig verktøy innen kjemi og biologi. Grunnideen er enkel: forskjellige stoffer absorberer lys / elektromagnetisk stråling bedre ved noen bølgelengder enn andre. Det er derfor noen materialer er gjennomsiktige, mens andre er farget, for eksempel. Når du skinner lys av en gitt bølgelengde gjennom en løsning, jo høyere konsentrasjon, desto mer lys vil den absorbere. For å beregne konsentrasjonen, må du sammenligne lesingen med avlesninger for standarder for kjent konsentrasjon. Fremgangsmåten nedenfor er en ganske generisk prosedyre skrevet med tanke på et kjemielæringslaboratorium, men det kan også endres for andre innstillinger.
Som alltid når du arbeider på et laboratorium, ta på deg beskyttelsesbriller, hansker og langermet frakk for å sikre din egen sikkerhet.
Klem gummipæren for å tømme den for luft, og plasser den på toppen av den oppgraderte pipetten, og la pæren slappe av slik at den suger vann opp i pipetten. Deretter tar du ut pæren og dekker toppen av pipetten med fingeren. Dette forsegler pipetten slik at løsningen inni ikke strømmer ut før fingeren er fjernet. Løft fingerkanten litt for å la en liten løsning strømme ut av pipetten, til du når ønsket volum. Øv med litt vann og et beger for å få en følelse av hvordan den graduerte pipetten fungerer. Koblingen under Ressurser-delen har et filmklipp som viser deg hvordan du bruker en pipette i tilfelle du aldri har jobbet med en før.
Merk 5 prøverør som standard 1-5. Du kan merke dem ved hjelp av maskeringstape og en penn eller med en tørr slettemarkør.
Velg fem konsentrasjoner for dine standarder. Du vil at standardkonsentrasjonene skal skilles fra hverandre med omtrent samme intervall - f.eks. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar, etc. - og i omtrent samme rekkevidde som det du forventer at ditt ukjente vil være. Bruk foreløpig følgende fem konsentrasjoner, men husk at du må endre disse når du utfører ditt eget eksperiment:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Deretter tar du 1 molar standardoppløsning og tilsett følgende mengder i reagensglass 1-5. Husk at disse beløpene blir beregnet ved hjelp av konsentrasjonene som er oppført ovenfor, så du må kanskje endre dem etter behov når du utfører ditt eget eksperiment.
Standard 1: 0,8 milliliter Standard 2: 1,6 milliliter Standard 3: 2,4 milliliter Standard 4: 3,2 milliliter Standard 5: 4 milliliter
Skyll den graduerte pipetten, og overfør deretter følgende mengder avionisert vann:
Standard 1: 7,2 milliliter Standard 2: 6,4 milliliter Standard 3: 5,6 milliliter Standard 4: 4,8 milliliter Standard 5: 4,0 milliliter
I utgangspunktet er ideen å bringe mengden løsning i hvert rør opp til 8 milliliter.
Sett parafilm på hvert av standardrørene og vend dem for å blande.
Merk ytterligere fem reagensglass som "Ukjent 1-5." Tilsett de samme mengdene av den ukjente eller testløsningen til hver som du brukte med 1 molar løsning for standardene. Med andre ord vil ukjent 1 inneholde 0,8 ml testløsning og 7,2 milliliter vann, ukjent 2 vil inneholde 1,6 ml testløsning og 6,4 milliliter vann, og så videre fremover.
Dekk hver av de ukjente med parafilm, og vend den forsiktig for å blande.
Slå på spektrofotometeret og la det varme opp. Hvor lang tid det er nødvendig vil avhenge av modellen og produsenten.
Sett bølgelengden på spektrofotometeret. Bølgelengden vil avhenge av typen kjemikalie i eksperimentet ditt. Foreløpig, anta 500 nm, men husk at du må endre dette for forskjellige eksperimenter.
Kalibrer spektrofotometeret ditt. Kalibreringsprosedyren vil variere avhengig av enheten du bruker. For Spectronic 20, en vanlig modell i laboratorier, vil du først justere maskinen slik at den leser "0 prosent T" når det ikke er lastet med noen kyvett, så juster den slik at den leser "100% T" når en tom kyvette som bare inneholder avionisert vann er lastet. Disse prosedyrene kan variere avhengig av hvilken type maskin du bruker, så se produsentens instruksjoner for detaljer.
Etter at maskinen er kalibrert, ta standard 1 reagensrør og hell innholdet i en ren kyvette til de når fyllelinjen. Tørk av kyvetten med en kimwipe for å fjerne fingeravtrykk eller annet smuss. Sett kyvetten inn i spektrofotometeret og registrer lesingen "% T".
Gjenta denne prosedyren for alle 10 prøvene. Vær RENGJØR å rengjøre kyvetten mellom prøvene for å sikre at resultatene dine er så nøyaktige som mulig.
Ta resultatene for standardene dine og legg dem inn i et regneark / grafprogram som Excel eller OpenOffice.
Bruk regnearkprogrammet til å dele 100 prosent av hver av "% T" -verdiene for standardene, og ta deretter loggen over resultatet. Denne beregningen vil gi deg absorbansen. Hvis du skriver inn formelen, vil regnearkprogrammet gjøre beregningen for deg.
Eksempel: Hvis% T er 50,6, vil formelen du legger inn i regnearkprogrammet være som følger:
logg (100 / 50,6)
Regnearkprogrammet vil gjøre regningen.
Gjør det samme for alle fem ukjente / eksperimentelle verdier.
Graf absorbansverdiene for alle fem standarder, med konsentrasjon på x-aksen og absorbansen på y-aksen. Bruk regnearkprogrammet, og tilpass en lineær ligning til denne grafen. Ligningen vil ha formen y = mx + b. De fleste regnearkprogrammer vil ha en lineær regresjonsfunksjon. Se brukerhåndboken for regnearkprogrammet for detaljer om hvordan du bruker funksjonen for lineær regresjon.
Ta ligningen for den best tilpassede linjen fra regnearkprogrammet, og løs det for y ved å trekke b fra begge sider og dele begge sider med m. Resultatet vil se slik ut:
(y - b) / m = x
hvor b og m er verdier funnet av regnearkprogrammet.
Sjekk absorbansverdiene for ukjente, og velg tre som faller omtrent i samme område som standardene. Bruk disse tre absorbansverdiene for de gjenværende beregningene. Hvis alle fem faller i samme område som standardene, kan du bruke alle fem i stedet, men du må bruke minst tre.
Plugg hver av de tre absorbansverdiene inn i ligningen din i stedet for y. Husk at ligningen din var i følgende form:
(y - b) / m = x
Så du vil koble absorbansverdien for hvert ukjent inn i ligningen i stedet for y, og deretter beregne x. Du kan bruke regnearkprogrammet til å gjøre denne beregningen for deg og gjøre det raskere. Du har nå beregnet konsentrasjonen av kjemikaliet av interesse i tre av dine utvannede ukjente. Den opprinnelige løsningen ble fortynnet for å forberede disse ukjente, så du må nå jobbe bakover og beregne konsentrasjonen av den opprinnelige løsningen basert på fortynningsfaktoren.
Hver ukjente prøve du satte inn i spektrofotometeret ble fortynnet med en annen mengde. Derfor bør du nå dele konsentrasjonen du har beregnet basert på absorbansen for hver ukjente avlesning med følgende:
Ukjent 1: Dele med 0,1 Ukjent 2: Dele med 0,2 Ukjent 3: Dele med 0,3 Ukjent 4: Dele med 0,4 Ukjent 5: Dele med 0,5
Husk imidlertid at disse tallene er basert på antagelsen om at du bruker fortynningene beskrevet ovenfor. Husk å endre disse verdiene hvis du fortynnet prøvene dine med en annen mengde.
Legg resultatene sammen, og del dem med antall resultater. Dette vil gi deg et gjennomsnitt. Rapporter dette nummeret som ditt funn for konsentrasjonen av den opprinnelige løsningen.
Ting du trenger
- Blyant
- Papir
- Kalkulator
- Hansker
- Beskyttelsesbriller
- Langermet kåpe
- Spektrofotometer
- Glasskuvetter
- Parafilm
- Kimwipes
- Avionisert vann
- Løsning du vil teste (av ukjent konsentrasjon)
- 1 molar standardoppløsning av kjemikaliet i testløsningen
- Gradert pipette og pære
- Reagensrør og reagensrørsstativ
- Begerglass
Tips
Denne prosedyren kan høres komplisert ut, men den er faktisk ganske grei når du har startet. Prøv å se de to videoene under Ressurser for å gjøre deg kjent med prosedyren.