Sodium dodecyl sulfat-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) er en biokjemisk metode for å identifisere proteiner i oppløsning. Som illustrert av Mathews et al i "Biokjemi," blir proteinprøver først lagt i "brønner" eller hull i den ene enden av polyakrylamidgelblokken. Et elektrisk felt påføres deretter på gelen. SDS, lagt til de ladede prøvene, negerer den naturlige ladningen av proteiner. Av denne grunn bestemmer proteinmolekylvekten alene migrasjonshastigheten til proteiner når de beveger seg gjennom gelen mot den positivt ladede polen, bemerker Bitesize Bio. Flere proteiner i samme prøve vil derfor skille seg fra hverandre og migrere til forskjellige posisjoner.
Orienter gelbildet. "Topp" er plasseringen av brønnene der prøvene opprinnelig ble lagt til. "Bunn" er hvor prøvene vandret mot og som oftest inneholder fargestofffronten som indikerer den migrerende fronten av prøvene. Enten venstre eller høyre skal inneholde en "markør", brukt som en forutsigbar molekylvektveiledning.
Merk prøvene for hver fil. Over toppen vil prøvene som er lagt til brønnene ha migrert vertikalt i "baner". Derfor kom alle stolpene som var synlige i en vertikal kolonne fra den ene prøven som var lastet rett over den. Bruk linjalen og pennen for å sette grenser på banene hvis det er vanskelig å visualisere kolonner.
Merk molekylstørrelsene til båndene i markeringsfeltet. Kommersielt tilgjengelige markører kommer med et bilde av båndmønsteret du kan forvente sammen med molekylvektene til hvert bånd. Band er de mørke horisontale "stolpene", som faktisk er farget protein innebygd i gelen.
Tegn lette horisontale linjer som strekker seg ut fra hvert markørbånd til den motsatte kanten av gelen. Vær forsiktig med å gjøre disse linjene parallelle med brønnene og fargestofffronten. Disse linjene indikerer hvor proteiner med molekylvekten som er angitt av hvert av markørbåndene, vil være plassert i hver bane. For eksempel et bånd i bane 4 som ligger like under linjen som strekker seg fra 25 kilodalton markørbånd antyder at bane 4-båndet er nesten, men ikke helt 25 kilodalton i molekylær vekt.
Merk hvert bånd i hver bane med beregnet molekylvekt. Bruk markørene som en veiledning, og estimer verdier mellom markørstørrelser.
Lag en liste over "proteiner" for hvert felt under gelbildet. Begynn med å oppgi hva som er kjent om hver prøve, for eksempel dens opprinnelse eller forhold. Oppgi deretter estimert molekylvekt for hvert bånd i banen. Baner med ett bånd indikerer at prøven bare inneholder ett protein. Baner med flere bånd indikerer tilstedeværelsen av flere proteiner. Band som kjører med migreringsfronten er mindre enn foreslått av nærmeste markør og kan sannsynligvis ikke forutsies bortsett fra som "mindre enn" markøren indikerer.
Merk proteiner i proteinlisten. Et "smurt" utseende kan indikere at for mange proteiner er til stede, eller at viskositeten til prøven påvirket migrasjonen hvis bånd ser ut til å gå utover kanten av banen eller er ganske stor sammenlignet med andre bånd, så er konsentrasjonen av proteinet sannsynligvis for høy og bør fortynnes i fremtiden elektroforese. En gråaktig fargetone gjennom hele banen, mørkere enn bakgrunnsgelfargen, indikerer skiller proteinfragmenter.
Bestem identiteten til proteinene i hver bane. Selv om dette bare gjøres ved å bruke molekylvekt, vil kilden til hvert felt sannsynligvis også indikere ledetråder. Tenk på at proteiner under noen forhold kan opprettholde en dimer- eller trimerforening på en gel. Derfor kan ett protein vises på en gel som tre forskjellige bånd. Selv om proteiner ikke kan identifiseres, kan båndets relative mørke innebære konsentrasjonen av proteinene i oppløsningen. Eventuelle nysgjerrige og ukjente proteiner kan isoleres direkte fra den originale gelen og sendes for identifikasjon.
Ting du trenger
- Foto av SDS-PAGE gel, farget
- Nøkkel for molekylvektmarkør brukt
- Hersker
- Penn