Komponenter av lyseringsbuffere

Lyse er et ord som kommer fra gresk og bare betyr "å splitte" eller "å sprekke." gjelder hva som skjer med celler i en lyseringsbuffer, en løsning som bryter dem åpne for å trekke ut deres innholdet. Forskere bruker lysebuffere når de ekstraherer DNA eller proteiner fra celler for analyse, spesielt når det gjelder bakterier. Typen av cellelysebuffer varierer avhengig av typen eksperiment, selv om følgende er noen vanlige valg.

TL; DR (for lang; Leste ikke)

Lyseringsbuffere hjelper til med å bryte åpne celler, slik at innholdet kan nås eller fjernes. Noen eksempler inkluderer salter, vaskemidler, chelateringsmidler og hemmere, og noen alkaliske kjemikalier.

Buffere stabiliserer pH mens cellene deler seg. Tris-HCL er en av de vanligste kjemikaliene for buffring ved pH 8. HEPES er en annen vanlig bufferkjemikalie i disse eksperimentene. Natriumkloridsalt kan også øke ionestyrken, den totale konsentrasjonen av oppløste stoffer utenfor cellene. Dette siste punktet har en viss betydning siden vann kan diffundere over cellemembraner fra regioner med lav oppløst konsentrasjon til områder med høy oppløselig konsentrasjon.

Vaskemidler oppløser cellemembraner slik at celleinnholdet kan unnslippe. Den har og amfipatiske molekylære struktur (dvs. molekyler med den ene enden som interagerer lett med vannmolekyler mens den andre ikke er hydrofobe eller "vannfryktige"). De kan oppløse fett ved å danne miceller, små klynger der de hydrofobe halene i vaskemiddelmolekylene peker innover mot fettmolekylene. Vanlige vaskemidler inkluderer natriumdodecylsulfat, eller SDS, NP-40 og tritonX.

Lyseringsbuffere inkluderer vanligvis også chelateringsmidler som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller etylenglykoltetraeddiksyre (EGTA). Disse kjemikaliene binder seg til metallioner med to positive ladninger (f.eks. Magnesium og kalsium), noe som gjør dem utilgjengelige for andre reaksjoner. Mange DNAser (proteiner som tygger opp DNA) og proteaser (proteiner som skjærer opp andre proteiner) trenger magnesiumioner til funksjon, så ved å frata dem denne viktige ingrediensen, hjelper EDTA og EGTA med å redusere nivået av protease eller DNAse aktivitet. De utelukker det imidlertid ikke helt, og noen proteaser er ikke avhengige av magnesiumkofaktorer, så lyseringsbuffere noen ganger inkluderer også kjemikalier som kalles proteasehemmere, som binder seg til proteaser, og hindrer dem i å fungere ordentlig.

Alkalisk lysis, en veldig vanlig teknikk for å rense plasmider fra bakterier, involverer tre løsninger. Den første inneholder glukose, tris-HCL-buffer, EDTA og RNAses. Glukosen skaper en høy oppløst konsentrasjon utenfor bakteriene, slik at de blir litt slappe, noe som gjør dem lettere å lysere. EDTA og tris-HCL fungerer som allerede beskrevet, mens RNAse vil tygge opp noe RNA inne i cellen for å få det ut av veien. Den andre løsningen lyserer faktisk cellene. Denne inneholder SDS vaskemiddel og NaOH, som øker pH til 12 eller høyere, denaturerer proteiner inne i cellen og får DNA til å skille seg ut i enkle tråder. Den tredje løsningen inneholder kaliumacetat for å gjenopprette pH til et mer nøytralt nivå slik at plasmid-DNA-strengene kan komme sammen igjen. I mellomtiden klumper de denaturerte proteinene seg sammen og utfelles, mens dodecyl-sulfationene kommer sammen med kaliumionene for å danne en uoppløselig forbindelse, som også utfelles fra løsningen.