Chemici gebruiken hoogwaardige vloeistofchromatografie of HPLC om mengsels van verbindingen te scheiden. In het algemeen bestaat de methode uit het injecteren van een monster in een kolom waar het wordt gemengd met een of meer oplosmiddelen. Verschillende verbindingen adsorberen of "kleven" in verschillende mate aan de kolom; en terwijl het oplosmiddel de verbindingen door de kolom duwt, zal een van de componenten van het mengsel als eerste de kolom verlaten. Het instrument detecteert de verbindingen wanneer ze de kolom verlaten en produceert een chromatogram dat bestaat uit een grafiek met retentietijd op de x-as en signaalintensiteit van de detector op de y-as. Wanneer de verbindingen de kolom verlaten, produceren ze "pieken" in het chromatogram. Over het algemeen geldt: hoe verder uit elkaar en hoe smaller de pieken in het chromatogram, hoe hoger de resolutie. Wetenschappers beschouwen een resolutie van 1,0 of hoger als een adequate scheiding.
Meet de breedte van twee aangrenzende pieken in het chromatogram door op te merken waar de x-as-waarden zich aan de basis van elke piek bevinden. De x-as vertegenwoordigt de retentietijd, meestal gemeten in seconden. Dus als een piek begint bij 15,1 seconden en eindigt bij 18,5 seconden, is de breedte (18,5 - 15,1) = 3,4 seconden.
Bepaal de retentietijden door de tijd te noteren, d.w.z. de locatie op de x-as, die overeenkomt met de locaties van de maxima van de pieken. Deze waarde ligt normaal gesproken ongeveer halverwege tussen de twee waarden die zijn gebruikt om de breedte in stap 1 te berekenen. Het in stap 1 gegeven voorbeeld zou bijvoorbeeld een maximum vertonen van ongeveer 16,8 seconden.
Bereken de resolutie, R, tussen twee pieken door:
R=\frac{RT_1-RT_2}{0.5(W_1+W_2)}
waar RT1 en RT2 vertegenwoordigen de retentietijden van pieken 1 en 2, en W1 en W2 vertegenwoordigen de breedtes van de pieken genomen aan hun basis. Als we het voorbeeld van stap 2 en 3 voortzetten, vertoont één piek een retentietijd van 16,8 seconden en een breedte van 3,4 seconden. Als de tweede piek een retentietijd van 21,4 seconden vertoonde met een breedte van 3,6 seconden, dan zou de resolutie zijn:
R=\frac{21.4-16.8}{0.5(3.4+3.6)}=1,3
Dingen die je nodig hebt
- HPLC-chromatogram
- Rekenmachine