DNA
Deoxyribonucleïnezuur en eiwitten. DNA is georganiseerd in eenheden die genen worden genoemd en die elk coderen voor een bepaalde RNA- of eiwitsequentie. Genen worden bestudeerd om meer te weten te komen over biologische structuur en functie, evolutie, ziekte en vele andere aspecten van levende systemen. Om genen in detail te bestuderen, moet DNA worden geïsoleerd en gezuiverd uit cellen van belang.
DNA-extractie
Hoewel DNA uit een enkele cel kan worden geëxtraheerd en bestudeerd, is het niet genoeg om met het blote oog te zien. Om een hoeveelheid te krijgen die voldoende is om te spoelen, geldt: hoe meer cellen u moet gebruiken, hoe beter (vele miljoenen).
Exacte protocollen variëren aanzienlijk om rekening te houden met de unieke kenmerken van specifieke monsters, maar de algemene stappen zijn homogenisatie, lysis, vertering, scheiding en verzameling. De procedure kan het beste worden uitgevoerd in een klein (afhankelijk van de grootte van het monster) glazen of plastic buisje.
Een monster wordt over het algemeen gemengd of vermalen om de cellen grondig van elkaar te scheiden. Dit maakt de celingrediënten beter toegankelijk voor de volgende reagentia. Detergens of enzymen worden vervolgens aan het homogenaat toegevoegd om de celmembranen te lyseren (en kernmembranen als de cellen eukaryoot zijn) om het DNA vrij te maken. Op dit punt is het DNA omgeven door eiwitten, lipiden, koolhydraten en al het andere dat zich in de cellen bevond.
Een verdere enzymatische vertering kan nodig zijn om eiwitten af te breken, zodat ze niet aan het DNA binden en de verzameling ervan verstoren. DNA wordt gescheiden van de rest van de celinhoud door koude, pure, ethyl- of isopropylalcohol toe te voegen. DNA is niet oplosbaar in deze alcoholen, dus het zal condenseren om te proberen het contact met de alcohol te minimaliseren. De gecondenseerde DNA's worden vervolgens verzameld, meestal door centrifugatie of spoelen.
DNA-spooling
DNA-verzameling door spooling is effectief wanneer een grote hoeveelheid DNA wordt verkregen uit een extractieprocedure. Het is ook een uitstekende demonstratiemethode omdat een indrukwekkende wirwar van puur DNA duidelijk zichtbaar is.
Om DNA te spoelen, moet de scheidingsstap zorgvuldig worden uitgevoerd. Als het geen onderdeel was van het eerder toegevoegde lysisreagensmengsel, moet een geconcentreerde zoutoplossing (natriumchloride) aan de oplossing worden toegevoegd vóór de alcoholtoevoegingsstap. De koude alcohol wordt langzaam langs de zijkant van de reageerbuis gegoten om een laag op de waterige oplossing te vormen, waarbij vermenging wordt vermeden. Als het goed wordt gedaan, vormt de alcohol zijn eigen laag bovenop de zoute laag. Dan komt het spoelen.
Om het DNA van de zoute laag te verzamelen, plaatst u voorzichtig een glazen roerstaafje door de alcohollaag totdat deze de bodem van de buis raakt. Draai de staaf langzaam tussen de vingers, terwijl u naar het grensvlak tussen de twee lagen kijkt. Als er voldoende DNA aanwezig is, zal het samenklonteren op het grensvlak tussen de lagen om een melkachtige doorschijnende massa te vormen. Draai de staaf om het DNA eromheen te wikkelen (dat is het spoelgedeelte) en trek het uit de buis. Het DNA kan worden overgebracht naar een ander buisje pure alcohol voor opslag of verdere analyse.
