Bij gelelektroforese worden monsters van DNA of eiwitten gescheiden - meestal op basis van grootte - door een elektrisch veld aan te leggen waardoor ze door een gel migreren. Het gebruik van gelelektroforese is routine in biomedische onderzoekslaboratoria en wordt gebruikt om een verscheidenheid aan verschillende vragen te beantwoorden, dus er is niet echt een universele manier om de resultaten te analyseren.
Verschillende technieken zoals Western-blotting, Northern-blotting en Southern-blotting hebben bijvoorbeeld allemaal betrekking op: gelelektroforese.
Als je aan het doen bent agarosegel elektroforese van DNA-monsters, de meest voorkomende procedure, moet u doorgaans ten minste twee dingen doen: 1) onderscheid maken tussen ongesneden plasmiden uit inserts, nicked plasmids en cut plasmids en 2) schat de grootte van de verschillende DNA-fragmenten met een standaardcurve Excel of rekenmachine.
Controleer uw labnotitieboekje om te bepalen welke monsters in welke rijen zijn geladen. Toen u de putjes voor uw gel laadde, had u de identiteit van elke baan/monster moeten noteren.
Meet met behulp van een liniaal de afstand op uw foto van de putjes tot de volgkleurstof, wat zal verder zijn gereisd dan een van de DNA-banden (met andere woorden, het zal onderaan de gel). Noteer dit nummer -- de eenheden die u gebruikt zijn niet belangrijk.
Meet de afstand op je foto van de putjes tot elk van de banden in de 'ladder' en deel die afstand door de afstand die de tracking kleurstof band. Deze berekening geeft u de relatieve mobiliteit van elke band.
Voorbeeld: stel dat de tracking-kleurstofband 6 inch heeft afgelegd en we hebben drie banden die 5, 4,5 en 3,5 inch hebben afgelegd.
Wat is hun relatieve mobiliteit? Antwoord: We delen 5, 4,5 en 3,5 door 6 om relatieve mobiliteiten van 0,833, 0,75 en 0,5833 te krijgen.
De fabrikant geeft u de grootte van elk fragment in de ladders die ze leveren, dus u zou deze informatie al moeten hebben.
Gebruik de Trendline-functie in uw spreadsheetprogramma om een vergelijking aan te passen aan de gegevens. Deze vergelijking moet een machtsvergelijking zijn (bijv. x ^ -2) en moet relatief goed passen bij de gegevens (R-coëfficiënt van ten minste 0,9). Dit creëert een curve en een standaardcurve Excel.
Onthoud dat kleinere DNA-fragmenten verder door de gel reizen dan grote DNA-fragmenten, dus degene die zich het dichtst bij de volgkleurstof bevinden, zijn de kleinste. Houd er echter rekening mee dat als plasmide (circulair) DNA is ongesneden, het zal "supercoiled" of gedraaid worden als een telefoonsnoer, waardoor het daadwerkelijk gaat reizen verder dan lineair DNA van dezelfde grootte.
Evenzo zal een "gepikt" plasmide dat onvolledig is geknipt, zich korter afstand dan lineair DNA van dezelfde grootte. Bijgevolg kunt u de grootte van ongeknipte plasmiden uit uw gel niet inschatten.
Koppel de banden in elke baan aan de identiteit van het monster dat u in die baan hebt geladen en bepaal of wat u ziet is wat u had verwacht. Dit hangt af van de aard van uw experiment.
In het algemeen zou je echter verwachten dat als je een insertplasmide met twee restrictie-enzymen zou verteren, de insert zou worden bevrijd van het plasmide.
Omdat het veel kleiner is dan het plasmide, zou je twee banden in die baan verwachten, een aan de bovenkant en de andere aan de onderkant. Een plasmide dat met slechts één restrictie-enzym is geknipt, zou slechts een enkele band moeten vormen die iets verder gaat dan het plasmide dat met twee is geknipt restrictie-enzymen, maar lang niet zo ver als de insert.
Meet de afstand van de putjes tot het gesneden plasmide en plaats banden met uw liniaal. Verdeel deze getallen door de afstand die door de tracking kleurstof is afgelegd om de relatieve mobiliteit van inserts te vinden en plasmiden te knippen.
