Biochemici en moleculair biologen gebruiken elektroforese om macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren te scheiden. Hierdoor kunnen wetenschappers individuele eiwitten of nucleïnezuursequenties in een complex mengsel isoleren en analyseren. Een typisch voorbeeld van elektroforese in het laboratorium is een microbioloog die Polymerase Chain Reaction (PCR) gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden die in een microbiële gemeenschap zijn geproduceerd. Ongeacht het doel vereist elektroforese altijd het gebruik van een bufferoplossing.
TL; DR (te lang; niet gelezen)
Elektroforese scheidt macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren op grootte, lading en andere eigenschappen. Voor elektroforese die door lading scheidt, gebruiken wetenschappers buffer om die lading door de gel te sturen. Buffer houdt de gel ook op een stabiele pH, waardoor veranderingen die kunnen optreden in het eiwit of nucleïnezuur worden geminimaliseerd als deze worden blootgesteld aan een onstabiele pH.
Principes van elektroforese
Elektroforese scheidt moleculen langs een gradiënt op basis van hun grootte, lading of andere eigenschappen. Die gradiënt kan een elektrisch veld zijn of, in het geval van Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), een denatureermiddel zoals een mengsel van ureum en formamide. Eiwitten migreren naar de anode als ze negatief geladen zijn en de kathode als ze positief geladen zijn. Omdat grotere moleculen langzamer migreren dan kleinere moleculen, kunnen wetenschappers de afgelegde afstand meten en logaritmen gebruiken om de grootte van de fragmenten te bepalen.
Denaturerende gradiëntgelelektroforese
Met DGGE beweegt DNA langs een gradiënt van toenemende denaturerende kracht totdat de kracht voldoende is om dat specifieke DNA-fragment volledig te denatureren of te ontvouwen. Op dit punt stopt de migratie. Wetenschappers kunnen deze methode gebruiken om fragmenten te scheiden op basis van hun individuele gevoeligheid voor denaturering.
Wat de buffer doet?
Bij elektroforese die op lading scheidt, zenden ionen in de buffer de voor de scheiding benodigde lading door. De buffer, door te voorzien in een reservoir van zwak zuur en base, houdt ook de pH binnen een nauw bereik. Dit is belangrijk omdat de structuur en lading van een eiwit of nucleïnezuur zal veranderen als het wordt blootgesteld aan significante pH-veranderingen, waardoor een goede scheiding wordt voorkomen.
Typische buffers
Verschillende buffers zijn ideaal om de elektroforesegel op verschillende gewenste pH-bereiken te houden. Typische buffers die door wetenschappers voor dit doel worden gebruikt, zijn azijnzuur, boorzuur, fosforzuur en citroenzuur, evenals glycine en taurine. Over het algemeen moet de pKa-waarde (zuurdissociatieconstante) dicht bij de vereiste pH liggen. Het verdient de voorkeur om buffers te gebruiken die een lage ladingsgrootte bieden om niet te veel stroom te geleiden.