Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) is een biochemische methode om eiwitten in oplossing te identificeren. Zoals door Mathews et al. in "Biochemistry" wordt geïllustreerd, worden eiwitmonsters eerst in "putjes" of gaten aan het ene uiteinde van het polyacrylamidegelblok geladen. Vervolgens wordt een elektrisch veld op de gel aangelegd. SDS, toegevoegd aan de geladen monsters, ontkent de natuurlijke lading van eiwitten. Om deze reden bepaalt alleen het eiwitmolecuulgewicht de migratiesnelheid van eiwitten terwijl ze door de gel naar de positief geladen pool bewegen, merkt Bitesize Bio op. Meerdere eiwitten in hetzelfde monster zullen daarom van elkaar scheiden en naar verschillende posities migreren.
Oriënteer de gelfoto. "Top" is de locatie van de putjes waar de monsters oorspronkelijk zijn toegevoegd. "Onder" is waar de monsters migreerden naar en bevat meestal het kleurstoffront dat het migrerende front van de monsters aangeeft. Links of rechts moet een "marker" bevatten, die wordt gebruikt als een voorspelbare gids voor het molecuulgewicht.
Label de monsters voor elke baan. Aan de bovenkant zullen de monsters die aan de putjes zijn toegevoegd verticaal in "banen" zijn gemigreerd. Daarom kwamen alle balken die zichtbaar zijn in een verticale kolom van het ene monster dat er direct boven was geladen. Gebruik de liniaal en de pen om randen op de banen aan te brengen als het moeilijk is om kolommen te visualiseren.
Label de moleculaire afmetingen van de banden in de markeringsbaan. In de handel verkrijgbare markers worden geleverd met een afbeelding van het bandpatroon dat u kunt verwachten, samen met de molecuulgewichten van elke band. Banden zijn de donkere horizontale "balken", die in feite gekleurd eiwit zijn dat in de gel is ingebed.
Trek lichte horizontale lijnen die zich uitstrekken van elke markeerband naar de tegenoverliggende rand van de gel. Zorg ervoor dat deze lijnen evenwijdig zijn aan de putjes en aan het kleurstoffront. Deze lijnen geven aan waar eiwitten met het door elk van de markerbanden aangegeven molecuulgewicht in elke baan zouden zijn gelokaliseerd. Bijvoorbeeld een band in baan 4 die zich net onder de lijn bevindt die zich uitstrekt van de 25 kilodalton markerband zou suggereren dat de band van baan 4 bijna maar niet helemaal 25 kilodalton in moleculair is gewicht.
Label elke band in elke baan met het geschatte molecuulgewicht. Gebruik de markeringen als richtlijn en schat waarden tussen markeringsformaten.
Maak onder de gelfoto een lijst met "eiwitten" voor elke baan. Begin met te vermelden wat er bekend is over elk monster, zoals de herkomst of omstandigheden. Maak vervolgens een lijst van het geschatte molecuulgewicht van elke band in de baan. Lanen met één band geven aan dat het monster slechts één eiwit bevat. Lanen met meerdere banden geven de aanwezigheid van meerdere eiwitten aan. Banden die met het migratiefront lopen, zijn kleiner dan gesuggereerd door de dichtstbijzijnde markering en kunnen waarschijnlijk niet worden voorspeld, behalve als "kleiner dan" de markering aangeeft.
Let in de lijst met eiwitten op eigenaardigheden. Een "uitgesmeerd" uiterlijk kan erop wijzen dat er te veel eiwitten aanwezig zijn of dat de viscositeit van het monster de migratie heeft beïnvloed. Als banden voorbij de rand van de baan of vrij groot zijn in vergelijking met andere banden, dan is de concentratie van dat eiwit waarschijnlijk te hoog en moet deze in de toekomst worden verdund elektroforese. Een grijsachtige tint over de hele baan, donkerder dan de achtergrondgelkleur, duidt op niet te onderscheiden eiwitfragmenten.
Bepaal de identiteit van de eiwitten in elke baan. Hoewel dit wordt gedaan met alleen molecuulgewicht, zal de bron van elke baan waarschijnlijk ook aanwijzingen geven. Bedenk dat eiwitten onder bepaalde omstandigheden een dimeer- of trimeerassociatie op een gel kunnen handhaven. Daarom kan één eiwit op een gel verschijnen als drie verschillende banden. Zelfs als eiwitten niet kunnen worden geïdentificeerd, kan de relatieve duisternis van de banden de concentraties van de eiwitten in oplossing impliceren. Alle nieuwsgierige en onbekende eiwitten kunnen direct uit de originele gel worden geïsoleerd en ter identificatie worden opgestuurd.
Dingen die je nodig hebt
- Foto van SDS-PAGE-gel, gekleurd
- Sleutel voor gebruikte molecuulgewichtmarker
- Heerser
- Pen