Componenten van lysisbuffers

Lyse is een woord dat uit het Grieks komt en alleen betekent "splitsen" of "barsten". heeft betrekking op wat er gebeurt met cellen in een lysisbuffer, een oplossing die ze openbreekt om hun inhoud. Wetenschappers gebruiken lysisbuffers bij het extraheren van DNA of eiwitten uit cellen voor analyse, vooral in het geval van bacteriën. Het type cellysisbuffer varieert afhankelijk van het soort experiment, hoewel de volgende veelvoorkomende keuzes zijn.

TL; DR (te lang; niet gelezen)

Lysisbuffers helpen bij het openbreken van cellen, zodat de inhoud ervan kan worden geopend of verwijderd. Enkele voorbeelden zijn zouten, detergenten, chelaatvormers en remmers, en sommige alkalische chemicaliën.

Buffers stabiliseren de pH terwijl de cellen zich splitsen. Tris-HCL staat als een van de meest voorkomende chemicaliën voor buffering bij pH 8. HEPES is een andere veel voorkomende bufferstof in deze experimenten. Natriumchloridezout kan ook de ionsterkte verhogen, de totale concentratie van opgeloste stoffen buiten de cellen. Dit laatste punt is van enig belang omdat water door celmembranen kan diffunderen van gebieden met een lage concentratie aan opgeloste stoffen naar gebieden met een hoge concentratie aan opgeloste stoffen.

Detergentia lossen celmembranen op zodat de inhoud van de cel kan ontsnappen. De hebben en amfipathische moleculaire structuur (d.w.z. moleculen met één uiteinde dat gemakkelijk interageert met watermoleculen, terwijl het andere hydrofobe of "watervrezende" uiteinde dat niet doet). Ze kunnen vetten oplossen door micellen te vormen, kleine clusters waar de hydrofobe staarten van de wasmiddelmoleculen naar binnen wijzen naar de vetmoleculen. Veelgebruikte detergentia zijn natriumdodecylsulfaat of SDS, NP-40 en tritonX.

Lysisbuffers omvatten typisch ook chelaatvormers zoals ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA). Deze chemicaliën binden aan metaalionen met twee positieve ladingen (bijvoorbeeld magnesium en calcium), waardoor ze niet beschikbaar zijn voor andere reacties. Veel DNA's (eiwitten die DNA opeten) en proteasen (eiwitten die andere eiwitten opsplitsen) hebben magnesiumionen nodig om functie, dus door hen dit belangrijke ingrediënt te ontnemen, helpen EDTA en EGTA om het niveau van protease of DNAse te verlagen activiteit. Ze sluiten het echter niet volledig uit, en sommige proteasen zijn niet afhankelijk van magnesium-cofactoren, dus lysisbuffers bevatten soms ook chemicaliën die proteaseremmers worden genoemd, die zich binden aan proteasen en voorkomen dat ze functioneren naar behoren.

Alkalische lysis, een veel voorkomende techniek voor het zuiveren van plasmiden uit bacteriën, omvat drie oplossingen. De eerste bevat glucose, tris-HCL-buffer, EDTA en RNAsen. De glucose zorgt voor een hoge concentratie opgeloste stoffen buiten de bacteriën, zodat ze een beetje slap worden, waardoor ze gemakkelijker te lyseren zijn. De EDTA en tris-HCL functioneren zoals reeds beschreven, terwijl het RNAse elk RNA in de cel zal opeten om het uit de weg te ruimen. De tweede oplossing lyseert in feite de cellen. Deze bevat SDS-detergens en NaOH, dat de pH tot 12 of hoger verhoogt, de eiwitten in de cel denatureert en ervoor zorgt dat het DNA in enkele strengen wordt gescheiden. De derde oplossing bevat kaliumacetaat om de pH naar een meer neutraal niveau te brengen, zodat de DNA-strengen van het plasmide weer bij elkaar kunnen komen. Ondertussen klonteren de gedenatureerde eiwitten samen en slaan neer, terwijl de dodecylsulfaat-ionen samen met de kaliumionen om een ​​onoplosbare verbinding te vormen, die ook uit de oplossing neerslaat.