Lipīgo gala enzīmu lietošanas priekšrocības

Molekulārā klonēšana ir izplatīta biotehnoloģijas metode, kas jāpārzina katram studentam un pētniekam. Molekulārā klonēšana, izmantojot fermenta veidu, ko sauc par restrikcijas fermentu, lai cilvēka DNS sagrieztu fragmentos, kurus pēc tam var ievietot baktēriju šūnas plazmīdu DNS. Ierobežojošie fermenti divkāršo DNS pārgriež uz pusēm. Atkarībā no ierobežojošā enzīma griezuma rezultāts var būt vai nu lipīgs, vai neass. Lipīgie gali ir noderīgāki molekulārajā klonēšanā, jo tie nodrošina cilvēka DNS fragmenta ievietošanu plazmīdā pareizajā virzienā. Ligēšanas procesam vai DNS fragmentu sapludināšanai ir nepieciešams mazāk DNS, ja DNS galiem ir lipīgi. Visbeidzot, vairāki lipīga gala ierobežošanas enzīmi var radīt to pašu lipīgo galu, kaut arī katrs ferments atpazīst atšķirīgu restrikcijas secību. Tas palielina varbūtību, ka jūsu interesējošo DNS reģionu var izgriezt ar lipīgiem gala enzīmiem.

Ierobežojošie enzīmi ir fermenti, kas sagriež atpazīst specifiskas divkāršās DNS sekvences un šajā secībā DNS pārgriež uz pusēm. Atpazīto secību sauc par ierobežošanas vietu. Ierobežojošos enzīmus sauc par endonukleāzēm, jo ​​tie sagriež divkāršās DNS, tieši tā DNS parasti pastāv, vietās, kas atrodas starp DNS galiem. Ir vairāk nekā 90 dažādu restrikcijas enzīmu. Katrs atpazīst atšķirīgu ierobežošanas vietu. Ierobežojošie enzīmi sašķeļ savas attiecīgās ierobežošanas vietas 5000 reizes efektīvāk nekā citas vietas, kuras tie neatpazīst.

Ierobežojošie fermenti ir divās vispārējās klasēs. Viņi vai nu sagriež DNS lipīgos vai neasos galos. Lipīgajam galam ir īss nukleotīdu apgabals, DNS celtniecības bloki, kas nav savienots. Šo nepāra reģionu sauc par pārkari. Tiek teikts, ka pārkare ir lipīga, jo tā vēlas un savienosies pārī ar citu lipīgu galu, kuram ir papildinoša pārkares secība. Lipīgie gali ir kā sen pazuduši dvīņi, kuri pēc satikšanās cenšas cieši apskaut viens otru. No otras puses, neasie gali nav lipīgi, jo visi nukleotīdi jau ir sapāroti starp diviem DNS pavedieniem. Lipīgo galu priekšrocība ir tāda, ka cilvēka DNS fragments baktēriju plazmīdā var iekļauties tikai vienā virzienā. Turpretī, ja gan cilvēka DNS, gan baktēriju plazmīdai ir neasi gali, cilvēka DNS var ievietot plazmīdā no galvas līdz astei vai no astes pret galvu.

Lai arī DNS ar nūjas galiem ir vieglāk atrast otru viņu “lipīguma” dēļ, nedz lipīgie, nedz neasie gali nevar saplūst nepārtrauktā DNS gabalā. Lai izveidotu nepārtrauktu un pilnīgi saistītu DNS gabalu, nepieciešams ferments, ko sauc par ligāzi. Ligāzes savieno nukleotīdu mugurkaulus lipīgajos vai neasajos galos, kā rezultātā notiek nepārtraukta nukleotīdu ķēde. Tā kā lipīgie gali viens otru atrada ātrāk, pateicoties savai pievilcībai, ligācijas procesam ir nepieciešams mazāk cilvēka DNS un mazāk plazmīdu DNS. DNS un plazmīdu neasie gali retāk atrod viens otru, un tāpēc neasu galu sasiešanai testa mēģenē jāievieto vairāk DNS.

Ierobežošanas vietas atrodas visā organismu genomā, bet nav vienmērīgi izvietotas. Plazmīdās tos var konstruēt tā, lai tie atrastos tieši blakus viens otram. Zinātniekiem, kuri vēlas no cilvēka genoma izgriezt cilvēka DNS fragmentu, jāatrod ierobežojuma vietas, kas atrodas fragmenta reģiona priekšā un aizmugurē. Papildus tam, lai nodrošinātu, ka DNS fragments tiek ievietots pareizajā virzienā, dažādi lipīgo galu enzīmi var radīt to pašu lipīgo galu, kaut arī tie atpazīst dažādas restrikcijas secības. Piemēram, BamHI, BglII un Sau3A ir atšķirīgas atpazīšanas secības, taču tām ir tāds pats GATC lipīgais gals. Tas palielina varbūtību, ka būs lipīgas gala ierobežošanas vietas, kas blakus jūsu cilvēka interesējošajam gēnam.