Ribojimo fermentų šaltinis

Nuo restrikcijos fermentų atradimo molekulinės biologijos sritis sparčiai tobulėjo dėl unikalaus šių baltymų gebėjimo specifiniu būdu suskaidyti DNR. Šie paprasti fermentai turėjo didžiulį poveikį viso pasaulio tyrimams; kaip bebūtų keista, turime bakterijų, už kurias dėkojame už šią mokslinę dovaną.

Ribojimo fermentai, dar vadinami restrikcijos endonukleazėmis, jungiasi prie DNR ir suskaido dvigubą grandinę, formuodami mažesnius DNR gabalėlius. Yra trys restrikcijos fermentų tipai; I tipo restrikcijos fermentai atpažįsta DNR seką ir atsitiktinai nutraukia grandinę daugiau nei tūkstantis bazių porų nuo vietos. II tipo restrikcijos fermentai, naudingiausi molekulinės biologijos laboratorijoms, atpažįsta ir nuspėja DNR grandinę pagal tam tikrą seką, kurios ilgis paprastai yra mažesnis nei dešimt bazių porų. III tipo restrikcijos fermentai yra panašūs į I tipo, tačiau jie atpjauna DNR apie trisdešimt bazių porų iš atpažinimo sekos.

Bakterijų rūšys yra pagrindinis komercinių restrikcijos fermentų šaltinis. Šie fermentai padeda apsaugoti bakterijų ląsteles nuo invazijos į svetimą DNR, pvz., Nukleorūgščių sekas, kurias virusai naudoja replikuotis ląstelės-šeimininkės viduje. Iš esmės fermentas susmulkins DNR į daug mažesnes dalis, kurios mažai kelia pavojų ląstelei. Fermentai pavadinti jį gaminančių bakterijų rūšimis ir padermėmis. Pavyzdžiui, pirmasis restrikcijos fermentas, ekstrahuotas iš Escherichia coli padermės RY13, vadinamas EcoRI, o penktasis fermentas, ekstrahuotas iš tos pačios rūšies, vadinamas EcoRV.

II tipo restrikcijos fermentai yra beveik universalūs viso pasaulio laboratorijose. DNR molekulės yra nepaprastai ilgos ir jas sunku tinkamai valdyti, ypač jei tyrėją domina tik vienas ar du genai. Ribojimo fermentai leidžia mokslininkui patikimai suskaidyti DNR į daug mažesnes dalis. Šis sugebėjimas manipuliuoti DNR leido pažengti restrikcijos žemėlapius ir molekulinį klonavimą.

Laboratorijoje labai naudinga ir patogu žinoti, kur tiksliai yra tam tikros restrikcijos vietos DNR grandinėje. Jei DNR seka yra žinoma, restrikcijos žemėlapį galima atlikti kompiuteriu, kuris gali greitai atvaizduoti visas įmanomas restrikcijos fermentų atpažinimo sekas. Jei DNR seka nėra žinoma, tyrėjas vis tiek gali sukurti bendrą žemėlapį, naudodamas skirtingus fermentus atskirai ir kartu su kitais fermentais skaldydamas molekulę. Naudojant dedukcinį samprotavimą, galima sukurti bendrą apribojimų žemėlapį. Klonuojant genus labai svarbu turėti ribojimų žemėlapį.

Molekulinis klonavimas yra laboratorijos metodas, kai genas yra išskiriamas iš tikslinės DNR molekulės, paprastai išgaunamos iš organizmo, restrikcijos fermentais. Tada genas įterpiamas į molekulę, vadinamą vektoriu, kuri paprastai yra maža cirkulinė DNR, vadinama plazmidėmis, kurios buvo modifikuotos nešti kelis restrikcinius fermentus sekos. Vektorius yra atidaromas restrikcijos fermentų pagalba, o tada genas įterpiamas į žiedinę DNR. Tuomet fermentas, vadinamas DNR ligaze, gali reformuoti ratą, įtraukdamas tikslinį geną. Tokiu būdu „klonavus“ geną, vektorių galima įterpti į bakterijų ląstelę, kad genas galėtų gaminti baltymą.