Natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezė (SDS-PAGE) yra biocheminis baltymų tirpale identifikavimo metodas. Kaip iliustruoja Mathews ir kt. „Biochemijoje“, baltymų mėginiai pirmiausia įkeliami į „duobutes“ arba skylutes viename poliakrilamido gelio bloko gale. Tada ant gelio padedamas elektrinis laukas. SDS, pridėtas prie pakrautų mėginių, paneigia natūralų baltymų krūvį. Dėl šios priežasties vien baltymų molekulinė masė lemia baltymų migracijos greitį, jiems judant geliu link teigiamai įkrauto poliaus, pažymi „Bitesize Bio“. Todėl keli baltymai tame pačiame mėginyje atsiskirs vienas nuo kito ir migruos į skirtingas pozicijas.
Orientuokite gelio nuotrauką. "Viršuje" yra šulinių, į kuriuos iš pradžių buvo pridėti mėginiai, vieta. "Apatinė" yra vieta, kur mėginiai migruoja link ir dažniausiai yra dažų priekis, nurodantis migruojančią mėginių priekį. Kairėje arba dešinėje turėtų būti „žymeklis“, naudojamas kaip prognozuojamas molekulinės masės orientatorius.
Pažymėkite kiekvienos juostos pavyzdžius. Viršuje į šulinius pridėti mėginiai bus vertikaliai migruoti „juostomis“. Todėl visos vertikaliame stulpelyje matomos juostos atsirado iš vieno mėginio, pakrauto tiesiai virš jo. Jei sunku vizualizuoti stulpelius, naudokite liniuotę ir rašiklį, kad juostos būtų kraštinės.
Pažymėkite juostų molekulinius dydžius žymėjimo juostoje. Prekyboje esantys žymekliai turi juostos modelio paveikslėlį, kurio galima tikėtis kartu su kiekvienos juostos molekuliniais svoriais. Juostos yra tamsios horizontalios „juostos“, kurios iš tikrųjų yra nudažyti baltymai, įterpti į gelį.
Nubrėžkite šviesias horizontalias linijas, besitęsiančias nuo kiekvienos žymeklio juostos iki priešingo gelio krašto. Būkite atsargūs, kad šios linijos būtų lygiagrečios šuliniams ir dažų priekiui. Šios linijos nurodo, kur kiekvienoje juostoje būtų molekulinės masės baltymai, pažymėti kiekviena žymeklio juosta. Pavyzdžiui, 4 juostos juosta, esanti tiesiai žemiau linijos, pratęsta nuo 25 kilodaltono žymeklio juosta rodo, kad 4 juostos juosta yra beveik, bet ne visai 25 kilodaltonų molekulinė svoris.
Kiekvienoje juostoje kiekvienoje juostoje pažymėkite apskaičiuotą molekulinę masę. Naudokite žymenis kaip orientyrą ir įvertinkite reikšmes tarp žymeklio dydžių.
Žemiau gelio nuotraukos sudarykite kiekvienos juostos „baltymų“ sąrašą. Pirmiausia nurodykite, kas yra žinoma apie kiekvieną mėginį, pvz., Jo kilmę ar sąlygas. Tada nurodykite apskaičiuotą kiekvienos juostos juostos molekulinę masę. Vienos juostos juostos rodo, kad mėginyje yra tik vienas baltymas. Kelių juostų juostos rodo, kad yra keli baltymai. Juostos, einančios su migracijos frontu, yra mažesnės, nei siūlo artimiausias žymeklis, ir greičiausiai jų negalima numatyti, išskyrus atvejus, kai „mažesnė“, nei rodo žymeklis.
Baltymų sąraše atkreipkite dėmesį į keistenybes. „Sutepta“ išvaizda gali reikšti, kad baltymų yra per daug arba kad mėginio klampa paveikė jo migraciją. Jei atrodo, kad juostos viršija juostos krašto arba yra gana dideli, palyginti su kitomis juostomis, greičiausiai to baltymo koncentracija yra per didelė ir ateityje turėtų būti praskiesta elektroforezė. Pilkas atspalvis visoje juostoje, tamsesnis už fono gelio spalvą, rodo neišsiskiriančius baltymų fragmentus.
Nustatykite baltymų tapatumą kiekvienoje juostoje. Nors tai daroma naudojant tik molekulinę masę, greičiausiai kiekvienos juostos šaltinis taip pat nurodys užuominas. Apsvarstykite, kad esant tam tikroms sąlygoms baltymai gali palaikyti dimerio arba trimerio ryšį ant gelio. Todėl vienas baltymas ant gelio gali pasirodyti kaip trys skirtingos juostos. Net jei baltymų neįmanoma nustatyti, santykinis juostų tamsumas gali reikšti baltymų koncentraciją tirpale. Bet kokius įdomius ir nežinomus baltymus galima išskirti tiesiogiai iš originalaus gelio ir nusiųsti identifikuoti.
Dalykai, kurių jums prireiks
- Nudažytos SDS-PAGE gelio nuotrauka
- Naudojamo molekulinės masės žymeklio raktas
- Liniuotė
- Rašiklis