粘着末端酵素を使用する利点

分子クローニングは、すべての学生と研究者が精通している必要がある一般的なバイオテクノロジーの方法です。 制限酵素と呼ばれる酵素の一種を使用して、ヒトDNAを断片に切断し、細菌細胞のプラスミドDNAに挿入できる分子クローニング。 制限酵素は二本鎖DNAを半分に切断します。 制限酵素に応じて、カットは粘着末端または平滑末端のいずれかになります。 粘着末端は、ヒトDNAフラグメントがプラスミドに正しい方向に挿入されることを保証するため、分子クローニングでより有用です。 ライゲーションプロセス、またはDNAフラグメントの融合では、DNAの末端が粘着末端である場合に必要なDNAが少なくなります。 最後に、複数の粘着末端制限酵素は、各酵素が異なる制限配列を認識していても、同じ粘着末端を生成する可能性があります。 これにより、目的のDNA領域が粘着末端酵素によって切り取られる可能性が高くなります。

制限酵素は、二本鎖DNAの特定の配列を切断して認識し、その配列でDNAを半分に切断する酵素です。 認識された配列は制限部位と呼ばれます。 制限酵素は、DNAの両端の間にある場所でDNAが通常存在する方法である二本鎖DNAを切断するため、エンドヌクレアーゼと呼ばれます。 90種類以上の制限酵素があります。 それぞれが異なる制限サイトを認識します。 制限酵素は、認識しない他の部位よりも5,000倍効率的にそれぞれの制限部位を切断します。

制限酵素には2つの一般的なクラスがあります。 DNAを粘着末端または平滑末端に切断します。 粘着末端には、対になっていないヌクレオチドの短い領域、つまりDNAの構成要素があります。 この対になっていない領域は、オーバーハングと呼ばれます。 オーバーハングは、相補的なオーバーハングシーケンスを持つ別の粘着末端とペアになりたいため、粘着性があると言われます。 粘着末端は、長い間失われた双子が出会ったら、お互いをしっかりと抱きしめようとしているようなものです。 一方、平滑末端は、すべてのヌクレオチドがDNAの2本の鎖の間ですでに対になっているため、粘着性ではありません。 粘着末端の利点は、ヒトDNAの断片が細菌プラスミドに一方向にしか適合できないことです。 対照的に、ヒトDNAと細菌プラスミドの両方が平滑末端を持っている場合、ヒトDNAはプラスミドに頭から尾または尾から頭まで挿入することができます。

粘着末端のあるDNAは「粘着性」があるため、お互いを見つけるのが簡単ですが、粘着末端も平滑末端も融合してDNAの連続部分になることはありません。 完全に結合したDNAの連続片を形成するには、リガーゼと呼ばれる酵素が必要です。 リガーゼは、粘着末端または平滑末端でヌクレオチドのバックボーンを接続し、ヌクレオチドの連続鎖をもたらします。 粘着末端は互いに引き付け合うため、お互いをより速く見つけるため、ライゲーションのプロセスに必要なヒトDNAとプラスミドDNAは少なくなります。 DNAとプラスミドの平滑末端はお互いを見つける可能性が低いため、平滑末端をライゲーションするには、より多くのDNAを試験管に入れる必要があります。

制限部位は生物のゲノム全体にありますが、等間隔ではありません。 プラスミドでは、それらは互いに隣接するように設計することができます。 ヒトゲノムからヒトDNAの断片を切り出したい科学者は、断片の領域の前と後ろにある制限部位を見つける必要があります。 DNAフラグメントが正しい方向に挿入されることを保証することに加えて、異なる粘着末端酵素は、異なる制限配列を認識していても、同じ粘着末端を作成できます。 たとえば、BamHI、BglII、およびSau3Aは異なる認識配列を持っていますが、同じGATC粘着末端を生成します。 これにより、目的のヒト遺伝子に隣接する粘着末端制限部位が存在する可能性が高くなります。