ウィスコンシン大学のBioWebWebサイトによると、PCRプライマーは短い合成オリゴヌクレオチド（通常は18の間）です。 ポリメラーゼ連鎖反応として知られる分子生物学技術でDNAの特定の領域を増幅するために使用される長さ25塩基まで） （PCR）。 DNA鎖の逆相補体となるように設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーの両方が必要であり、目的のDNA領域に隣接して結合します。 科学者がDNAの特定の遺伝子または領域の研究を行いたい場合、最初にPCRを実行して、作業するのに十分なターゲット領域を取得する必要があります。 関心のある領域のプライマー配列を設計することは、それらが以前に発表された研究または商業的手段によってまだ利用可能でない場合に必要かもしれません。
目的の遺伝子またはDNA領域のヌクレオチド配列を取得し、増幅するフラグメントの長さを決定します。 フォワードおよびリバースプライマーは、目的のフラグメントの最初と最後に結合するように設計されています。 通常、従来のPCR法では、100〜1,000塩基対の長さの領域に隣接するプライマーを使用しますが、リアルタイムPCR法では、約50〜200塩基対の長さのフラグメントを使用します。
配列のどこにプライマーを配置するかを決定します。 たとえば、シーケンスの5 'または3'の終わりの近く、または中央の場所が必要な場合があります。 必要に応じて、イントロンにまたがるプライマーの位置を指定します。
長さが18〜24塩基になるようにプライマーを設計します。 ヴィンセントR。 Brinkmann Instruments Inc.のPrezioso、Ph。D。は、この長さは目的のDNA領域に非常に特異的であるのに十分な長さであるが、容易に結合（アニーリング）するのに十分短いことを示唆しています。 プライマーの融解温度（Tm）は、摂氏55〜80度で、摂氏90度以上で完全に融解するのに十分な低さですが、アニーリングを可能にするのに十分な高さである必要があります。 GC含量（シーケンス内のGsとCsのパーセンテージ）は40〜60パーセントである必要があります。 プライマー配列の3 '末端は、結合を促進するためにCまたはG（GCクランプと呼ばれる）で終わる必要があります。これは、GおよびCが ヌクレオチドはより強い結合を持っていますが、配列の最後の5塩基に3つ以上のGまたはCが含まれることは避けてください。
ミスプライミングを引き起こす可能性があるため、1つの塩基を4つ以上（ACCCC ...など）または4つ以上のジヌクレオチドリピート（ATATATAT ...など）を実行することは避けてください。 プライマー内相同性のないプライマーを設計する（1つ内で補完する3つ以上の塩基 プライマー自体）またはプライマー間相同性（フォワードおよびリバースプライマーが相補的である場合） シーケンス）。 これにより、セルフダイマーまたはプライマーダイマーが発生する可能性があり、プライマーは目的のDNA配列に結合するのではなく、自身に結合します。
プライマーの設計を支援したり、プライマー配列の自己相補性やヘアピンなどの二次構造を作成する可能性を確認したりするのに役立つオンラインリソースやWebサイトを使用してください。 一部のプライマー設計Webサイトには、マサチューセッツ工科大学のPrimer3、米国国立バイオテクノロジー情報センターのPrimer-Blast、Integrated DNATechnologiesのOligoAnalyzerなどがあります。
