שיבוט DNA: הגדרה, תהליך, דוגמאות

אפשר לשכפל אורגניזמים שלמים כמו דולי הכבשה, אך שיבוט DNA שונה. היא משתמשת בטכניקות של ביולוגיה מולקולרית עותקים זהים של רצפי DNA או גנים בודדים.

בעזרת שיטות הנדסה גנטית מזהים ומבודדים מקטעים של הקוד הגנטי של ה- DNA. שיבוט DNA ואז מעתיק את ה- חומצות גרעין רצפים בקטעים.

ניתן להשתמש בעותקים זהים המתקבלים למחקר נוסף או ליישומי ביוטכנולוגיה. לעתים קרובות הגן המועתק מקודד חלבון שיכול להוות חלק מהטיפולים הרפואיים. טכנולוגיית DNA כולל שיבוט DNA תומך בהבנת האופן שבו גנים עובדים וכיצד הקוד הגנטי של בני האדם משפיע על תפקוד הגוף.

שיבוט DNA הוא תהליך הביולוגיה המולקולרית של יצירת עותקים זהים של מקטעי DNA הנמצאים בכרומוזומים המכילים את הקוד הגנטי של אורגניזמים מתקדמים.

התהליך מייצר כמויות גדולות של למקד לרצפי DNA. מטרת שיבוט ה- DNA היא לייצר את רצפי ה- DNA היעד עצמם או לייצר את החלבונים המקודדים ברצפי היעד.

שתי השיטות הנהוגות בשיבוט DNA נקראות וקטור פלסמיד ו תגובת שרשרת פולימראז (PCR). בתוך ה וקטור פלסמיד שיטה, גזרי DNA נחתכים באמצעות אנזימי הגבלה לייצור שברי DNA, והקטעים המתקבלים מוכנסים לווקטורי שיבוט הנקראים פלסמידים לצורך שכפול נוסף. הפלסמידים ממוקמים בתאי חיידקים המייצרים לאחר מכן את עותקי ה- DNA או את החלבונים המקודדים.

בתוך ה שיטת PCR, קטע גדילי הדנ"א שיש לשכפל מסומן באנזימים הנקראים פריימרים. אנזים פולימראז מייצר העתקים של החלק המסומן של גדיל ה- DNA. שיטה זו אינה משתמשת באנזימי הגבלה ויכולה לייצר DNA משובט מדגימות קטנות. לפעמים משתמשים בשתי שיטות טכנולוגיית ה- DNA יחד כדי לשלב את התכונות הטובות ביותר של כל אחת בתגובה כוללת.

הווקטור של השיטה מתייחס לפלסמיד המשמש להחזקת קטע ה- DNA היעד שיש לשכפל. פלסמידים הם קווצות עגולות קטנות של DNA לא כרומוזומלי נמצא באורגניזמים רבים כולל חיידקים ווירוסים.

פלסמידים בקטריאליים הם הווקטור המשמש להכנסת קטע ה- DNA היעד לתאי חיידקים להעתקה נוספת.

בחירה ובידוד של ה- DNA היעד: לפני שניתן להתחיל בתהליך שיבוט ה- DNA, יש לזהות את רצפי ה- DNA, במיוחד את ההתחלה ואת הקצוות של מקטעי ה- DNA.

רצפי DNA כאלה ניתן למצוא על ידי שימוש ב- DNA משובט קיים עם רצפים ידועים או על ידי לימוד החלבון המיוצר על ידי רצף ה- DNA היעד. ברגע שהרצף ידוע, ניתן להשתמש באנזימי ההגבלה המתאימים.

חיתוך ה- DNA היעד עם אנזימי הגבלה: אנזימי הגבלה נבחרים כדי לחפש את קוד ה- DNA בתחילת וסוף רצפי היעד.

כאשר אנזימי ההגבלה מוצאים רצף מקודד מיוחד של זוגות בסיס הנקראים אתרי הגבלה, הם לצרף את עצמם ל- DNA באותו מקום ולהתפתל סביב מולקולת ה- DNA, לנתק את ה- DNA גָדִיל. מקטעי ה- DNA החתוכים המכילים את רצף היעד זמינים כעת לשכפול.

בחירת וקטור הפלסמיד והכנסת ה- DNA היעד: פלסמיד מתאים מכיל באופן אידיאלי את אותם רצפי קידוד ה- DNA כמו גדיל ה- DNA ממנו נחתך ה- DNA היעד. גדיל ה- DNA המעגלי של הפלסמיד נחתך באותם אנזימי הגבלה ששימשו לחיתוך ה- DNA היעד.

א אנזים ליגאז DNA משמש לקידום קישור קטע ה- DNA, וקצות קטע ה- DNA היעד מתחברים לקצוות החתוכים של ה- DNA פלסמיד. ה- DNA היעד מהווה כעת חלק מגדיל ה- DNA הפלסמיד המעגלי.

הכנסת הפלסמיד לתא חיידקי: לאחר שהפלסמיד מכיל את רצף ה- DNA שיש לשכפל, השיבוט בפועל יכול להתרחש באמצעות תהליך הנקרא טרנספורמציה חיידקית. הפלסמידים מוחדרים לתא חיידקי כמו E. coli, והתאים עם מקטעי ה- DNA החדשים יתחילו לייצר עותקים ואת החלבונים המתאימים.

בשינוי חיידקי מודגרים תאי המארח והפלסמידים יחדיו בטמפרטורת הגוף למשך כ- 12 שעות. התאים סופגים חלק מהפלסמידים ומתייחסים אליהם כאל DNA פלסמיד משלהם.

קצירת ה- DNA והחלבונים המשובטים: לרוב הפלסמידים המשמשים לשיבוט DNA יש גנים עמידים לאנטיביוטיקה שולבו ב- DNA שלהם. כאשר תאי החיידק סופגים את הפלסמידים החדשים הם הופכים עמידים לאנטיביוטיקה.

כאשר מטפלים בתרבית באנטיביוטיקה, רק אותם תאים שקלטו את הפלסמידים החדשים שורדים. התוצאה היא תרבית טהורה של תאי חיידקים עם DNA משובט. לאחר מכן ניתן לקצור DNA זה או לייצר את החלבון המתאים.

ה PCR השיטה פשוטה יותר ומעתיקה את ה- DNA הקיים במקום. זה לא דורש חיתוך באנזימי הגבלה או הכנסה פלסמידDNA רצפים. זה עושה את זה מתאים במיוחד לשיבוט דגימות DNA עם מספר מוגבל של גדילי DNA. אמנם השיטה יכולה לשבט DNA, אך לא ניתן להשתמש בה לייצור החלבון המתאים.

ביטול סלילי הדנ"א: DNA בכרומוזומים מפותל היטב במבנה סליל כפול. חימום ה- DNA ל 96 מעלות צלזיוס בתהליך שנקרא דנטורציה הופך את מולקולת ה- DNA לסליל ונפרדת לשני גדילים. הפרדה זו נדרשת מכיוון שניתן לשכפל רק גדיל יחיד של DNA בו זמנית.

בחירת הפריימרים: כמו עם שיבוט DNA של וקטור פלסמיד, יש לזהות את רצפי ה- DNA שיש לשכפל תוך דגש מיוחד על ההתחלה והקצוות של מקטעי ה- DNA. פריימרים הם אנזימים הנצמדים לרצפי קוד DNA ספציפיים, ויש לבחור אותם כדי לסמן את מקטעי ה- DNA היעד. הפריימרים הנכונים יתחברו לרצפי מולקולת ה- DNA כדי לסמן את ההתחלה ואת הקצוות של קטעי היעד.

חישול התגובה לקשירת התחל: קירור התגובה לכ 55 מעלות צלזיוס נקרא רִכּוּך. עם התקררות התגובה, הפרימרים מופעלים ומצמידים את עצמם לחוט ה- DNA בכל קצה של קטע DNA יעד. הפריימרים פועלים רק כסמנים, ואין צורך לחתוך את גדיל ה- DNA.

הפקת עותקים זהים של קטע ה- DNA היעד: בתהליך שנקרא סיומת, אנזים TAQ פולימראז הרגיש לחום נוסף לתגובה. לאחר מכן מחממים את התגובה ל 72 מעלות צלזיוס, ומפעילים את האנזים. האנזים הפעיל של פולימראז ה- DNA נקשר לפריימרים ומעתיק את רצף ה- DNA ביניהם. תהליך רצף ושיבוט ה- DNA הראשוני הושלם.

הגדלת התשואה של ה- DNA המשובט: תהליך החישול וההרחבה הראשוני יוצר מעט יחסית עותקים של מקטעי גדילי ה- DNA הזמינים. כדי להגדיל את התשואה באמצעות שכפול נוסף של ה- DNA, התגובה צוננת שוב כדי להפעיל מחדש את הפריימרים ולתת להם להיקשר לחוטי DNA אחרים.

לאחר מכן, חימום מחדש של התגובה מפעיל את אנזים הפולימראז שוב ונוצרים עותקים נוספים. ניתן לחזור על מחזור זה 25 עד 30 פעמים.

שיטת וקטור הפלסמיד מסתמכת על אספקה ​​ראשונית בשפע של DNA לחיתוך ולהכנסה לפלסמידים. מעט מדי DNA מקורי גורם לפחות פלסמידים ולהתחלה איטית של ייצור DNA משובט.

שיטת ה- PCR יכולה לייצר כמות גדולה של DNA מכמה גדילי DNA מקוריים, אך מכיוון שה- DNA אינו מושתל בתא חיידקי, ייצור חלבונים אינו אפשרי.

כדי לייצר את החלבון המקודד בשברי הדנ"א שיש לשכפל מדגימת דנ"א ראשונית קטנה, ניתן להשתמש בשתי השיטות יחד, והן יכולות משלימים זה את זה. ראשית משתמשים בשיטת ה- PCR כדי לשכפל DNA מדגימה קטנה ולייצר עותקים רבים.

לאחר מכן משתמשים במוצרי ה- PCR בשיטת וקטור הפלסמיד לצורך השתלת ה- DNA המיוצר בתאי חיידקים שייצרו את החלבון הרצוי.

ביולוגיה מולקולרית משתמשת בשיבוט גנים ושכפול DNA למטרות רפואיות ומסחריות. החיידקים עם רצפי ה- DNA המשובטים משמשים לייצור תרופות ולהחלפת חומרים שאנשים עם הפרעות גנטיות אינם יכולים לייצר בעצמם.

שימושים אופייניים כוללים:

• הגן עבור אינסולין אנושי משובט בחיידקים שמייצרים אז את האינסולין המשמש את חולי הסוכרת.
• מפעיל פלסמינוגן רקמות מיוצר מ- DNA משובט ומשמש לעזרה למנוע קרישי דם.
• הורמון גדילה אנושי ניתן לייצר ולנהל אנשים שאינם יכולים לייצר זאת בעצמם.

ביוטכנולוגיה משתמשת גם בשיבוט גנים בחקלאות כדי ליצור מאפיינים חדשים בצמחים ובעלי חיים או לשפר את המאפיינים הקיימים. ככל שמשובטים יותר גנים, מספר השימושים האפשריים גדל באופן אקספוננציאלי.

מולקולות DNA מהוות חלק קטן מהחומר בתא חי, וקשה לבודד את ההשפעות של הגנים הרבים. שיטות השיבוט של ה- DNA מספקות כמויות גדולות של רצף DNA ספציפי ללימוד, וה- DNA מייצר חלבונים בדיוק כפי שהיה בתא המקורי. שיבוט DNA מאפשר לחקור פעולה זו עבור גנים שונים בבידוד.

יישומי מחקר וטכנולוגיית DNA אופייניים כוללים בחינה:

• פונקציה של גן.
• מוטציות של גן.
• ביטוי גני.
• מוצרי גנים.
• פגמים גנטיים.

כאשר משובטים יותר רצפי DNA, קל יותר למצוא ולשבט רצפים נוספים. ניתן להשתמש בקטעי ה- DNA המשובטים הקיימים כדי לקבוע אם קטע חדש תואם את הישן ואילו חלקים שונים. זיהוי רצף DNA מטרה מהיר יותר ומדויק יותר.

ב טיפול גנטי, מוצג גן משובט לתאי האורגניזם שהגן הטבעי שלו נפגע. גן חיוני המייצר חלבון הנדרש לתפקוד אורגניזם ספציפי יכול להיות מוטציה, שינוי על ידי קרינה או מושפע מנגיפים.

כאשר הגן אינו פועל כראוי, חסר חומר חשוב בתא. טיפול גנטי מנסה החלף את הגן בגרסה משובטת שתייצר את החומר הנדרש.

הטיפול בגנים עדיין ניסיוני, ומעט מטופלים נרפאו באמצעות הטכניקה. הבעיות טמונות בזיהוי הגן היחיד האחראי על מצב רפואי ומסירת עותקים רבים של הגן לתאים הנכונים. ככל ששיבוט דנ א התרחב יותר, הטיפול הגנטי הוחל בכמה מצבים ספציפיים.

יישומים שהצליחו לאחרונה כללו:

• מחלת פרקינסון: באמצעות וירוס כווקטור הוחדר גן הקשור למחלת פרקינסון למוח התיכון. המטופלים חוו מיומנויות מוטוריות משופרות ללא תופעות לוואי שליליות.
• מחסור באדנוזין דימינאז (ADA): הפרעה חיסונית גנטית טופלה על ידי הסרת תאי גזע בדם של המטופלים והחדרת הגן ADA. חולים הצליחו לייצר לפחות חלק מה- ADA שלהם כתוצאה מכך.
• דַמֶמֶת: אנשים עם המופיליה אינם מייצרים חלבונים ספציפיים המסייעים לקרישת דם. גן לייצור אחד החלבונים החסרים הוכנס לתאי הכבד של החולים. החולים ייצרו את החלבון ואירועי הדימום הופחתו.

טיפול גנטי הוא אחד היישומים המבטיחים ביותר של שיבוט דנ"א, אך שימושים חדשים אחרים עשויים להתרבות ככל שנחקרים יותר רצפי DNA ותפקידם נקבע. שיבוט DNA מספק את חומר הגלם להנדסה גנטית בכמויות הדרושות.

כאשר ידוע על תפקיד הגנים וניתן להבטיח את תפקודם התקין באמצעות החלפת פגמים גנים, מחלות כרוניות רבות ואף סרטן ניתן לתקוף ולטפל ברמה הגנטית באמצעות DNA טֶכנוֹלוֹגִיָה.

תוכן קשור:

• מאפייני המושבה של E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: הגדרה, פונקציה, מבנה