בביולוגיה מולקולרית, יכול להיות בחירת חיץ טובה והכנה לשלבי בידוד DNA שונים ההבדל בין מעבר לביטוי חלבון או פתיחת ערכת הכנה מקסית נוספת כדי להתחיל על. למרות חשיבותם המכריעה, מתכוני חיץ הם לרוב בדיוק המתכונים שנכתבו ללא הסבר או נימוק לרכיבים השונים. חיץ כזה הוא חיץ גלוקוז-טריס-EDTA או GTE.
לשם מה משמש GTE?
GTE משמש להשעיה חוזרת של כדורי תאי חיידקים לפני הבהרה (פריצת) התאים וקצירת ה- DNA של הפלסמיד שבתוכם. ליזוזים, המרכך את קרומי התאים, מתווסף לעיתים קרובות יחד עם חיץ ה- GTE. השגת השעיה הומוגנית של תאים שלמים במהלך שלב זה, כך שתמיסת תמוגה שנוספה לאחר מכן יכולה להגיע לכל התאים היא המפתח להשגת תשואות DNA טובות. GTE נועד לעשות זאת תוך מתן סביבה יציבה ל- DNA.
גלוקוז לאוסמולריות
סוכר גלוקוז 50 מ"מ (מילימולרי) מתווסף למאגר ה- GTE כדי לשמור על אוסמולריות כאשר ריכוז המומס מחוץ לתאים קרוב לזה שבתוך התאים. זה מונע תמוגה מוקדמת של תאים, שעלולה לגרום לתשואות DNA נמוכות יותר עקב צבירה והשפלה. שאר מרכיבי החיץ תורמים גם לאוסמולריות של התמיסה, אך גלוקוז, להיות לא אלקטרוליט, זו בחירה טובה כי זה לא מפריע למאגר הפתרון נכסים.
טריס ליציבות pH
טריס הוא השם הקצר עבור טריס (הידרוקסימתיל) אמינמתאן, שהוא חיץ pH נפוץ מאוד. במקרה של חיץ GTE, מלח החומצה (טריס- HCl) מתווסף למאגר בריכוז של 25 מ"מ. זה שומר על ה- pH של התמיסה ב- 8.0 כמעט פיזיולוגי, pH אידיאלי למניעת הידרוליזה חומצית (השפלה) של ה- DNA פלסמיד ותגובות לוואי לא רצויות של רכיבי התאים האחרים.
EDTA מונע פירוק DNA
EDTA, או חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, לוכדת או "מצרדת" יוני מתכות מתוך תמיסה, ומונעת מהם להשתתף בתגובות לוואי לא רצויות. במאגר GTE, EDTA מתווסף ב -10 מ"מ. מטרתו העיקרית היא במאגר לעגל אבץ, מגנזיום וסידן חופשיים, ובכך למנוע את פירוק ה- DNA במסלולים מסוימים הדורשים מתכות אלה.
כמה טיפים חשובים
שמור על חיץ ה- GTE קר והכין אותו בכמויות קטנות כדי למנוע צמיחה של חיידקים לא מכוונים בו. סוכר ו- pH מבוקר מהווים מדיום גדילה נהדר. השתמש תמיד במים מטוהרים. במי ברז יכול להיות עודף של יונים ממתכת מהצינורות, מה שיכול להכריע את יכולתו של ה- EDTA ללכוד. אם אתה חושד בנוכחות RNA מפריע במדגם שלך, הוסף RNase A ב 100 מיקרוגרם למיליליטר למאגר ה- GTE שלך כדי למנוע את הבעיה.