היתרונות בשימוש באנזימים של סוף דביק

שיבוט מולקולרי הוא שיטת ביוטכנולוגיה נפוצה שכל סטודנט וחוקר צריך להכיר. שיבוט מולקולרי באמצעות סוג של אנזים הנקרא אנזים הגבלה לחיתוך דנ"א אנושי לרסיסים שאותם ניתן להכניס ל DNA פלסמיד של תא חיידקי. אנזימי הגבלה חותכים די-אן-אי גדילי לחצי. בהתאם לאנזים ההגבלה, החיתוך יכול לגרום לקצה דביק או לקצה קהה. קצוות דביקים שימושיים יותר בשיבוט מולקולרי מכיוון שהם מבטיחים כי קטע ה- DNA האנושי מוחדר לפלסמיד בכיוון הנכון. תהליך הקשירה, או איחוי של שברי DNA, דורש פחות DNA כאשר ל- DNA יש קצוות דביקים. לבסוף, אנזימים להגבלת קצה דביקים מרובים יכולים לייצר את אותו קצה דביק, למרות שכל אנזים מזהה רצף הגבלה שונה. זה מגדיל את הסבירות שאזור ה- DNA שמעניין אותך יכול להיחתך על ידי אנזימי קצה דביקים.

אנזימי הגבלה הם אנזימים החותכים מזהים רצפים ספציפיים ב- DNA דו-גדילי וחותכים את ה- DNA לשניים ברצף זה. הרצף המוכר נקרא אתר ההגבלה. אנזימי הגבלה נקראים אנדונוקליזות מכיוון שהם חותכים דנ"א דו גדילי, כך קיים בדרך כלל דנ"א, במיקומים שנמצאים בין קצות ה- DNA. ישנם יותר מ -90 אנזימי הגבלה שונים. כל אחד מזהה אתר הגבלה מובהק. אנזימי הגבלה חותכים את אתרי ההגבלה שלהם בהתאמה פי 5,000 ביעילות רבה יותר מאתרים אחרים שאינם מכירים.

אנזימי הגבלה מגיעים בשתי מחלקות כלליות. הם חותכים DNA לקצוות דביקים או קצוות קהים. בקצה דביק יש אזור קצר של נוקלאוטידים, אבני הבניין של ה- DNA, שאינו מזווג. אזור לא מזווג זה נקרא מעבר. אומרים שהסככה דביקה מכיוון שהיא רוצה ותשתלב עם קצה דביק אחר שיש לו רצף סיבוב משלים. קצוות דביקים הם כמו תאומים שאבדו מזמן המבקשים לחבק זה את זה בחוזקה ברגע שהם נפגשים. מצד שני, קצוות קהים אינם דביקים מכיוון שכל הנוקליאוטידים כבר משויכים בין שני גדילי ה- DNA. היתרון של קצוות דביקים הוא שקטע של DNA אנושי יכול להשתלב רק בפלסמיד חיידקי בכיוון אחד. לעומת זאת, אם גם לדנ"א האנושי וגם לפלסמיד החיידקי יש קצוות קהים, ניתן להכניס את הדנ"א האנושי אל הזנב או מהזנב אל הראש לפלסמיד.

למרות ש- DNA עם קצוות מקל קל יותר למצוא זה את זה בגלל ה"דביקות "שלהם, לא קצוות דביקים ולא קצוות קהים יכולים להתמזג יחד לפיסת DNA רציפה. היווצרות פיסת DNA רצופה המקושרת לחלוטין מחייבת אנזים הנקרא ליגאז. ליגזות מחברות בין עמוד השדרה של נוקלאוטידים בקצוות הדביקים או הבוטים, וכתוצאה מכך נוצרת שרשרת רציפה של נוקליאוטידים. מכיוון שקצוות דביקים מוצאים זה את זה מהר יותר בשל משיכתם זה לזה, תהליך הקשירה דורש פחות DNA אנושי ופחות DNA פלסמיד. הקצוות הקהים של ה- DNA והפלסמידים נוטים פחות למצוא זה את זה, ולכן קשירת קצוות קהים מחייבת להכניס יותר DNA למבחנה.

אתרי הגבלה ממוקמים בכל הגנום של אורגניזמים, אך אינם מרווחים באופן שווה. בפלסמידים ניתן לתכנן אותם כך שהם ימצאו זה ליד זה. מדענים שרוצים לחתוך קטע של DNA אנושי מהגנום האנושי חייבים למצוא אתרי הגבלה שנמצאים מלפנים ומאחור לאזור השבר. בנוסף להבטחת הכנסת קטע DNA בכיוון הנכון, אנזימי קצה דביקים שונים יכולים ליצור את אותו קצה דביק למרות שהם מזהים רצפי הגבלה שונים. לדוגמא, ל- BamHI, BglII ו- Sau3A יש רצפי זיהוי שונים אך מייצרים את אותו קצה דביק של GATC. זה מגדיל את הסבירות שיהיו אתרי הגבלת קצה דביקים המאגפים את הגן האנושי שלך.