מקור אנזימים להגבלה

מאז גילוי אנזימי ההגבלה, תחום הביולוגיה המולקולרית התקדם במהירות בשל יכולתם הייחודית של חלבונים אלה לנתק DNA באופן ספציפי. לאנזימים פשוטים אלה הייתה השפעה עמוקה על המחקר בכל רחבי העולם; באופן מוזר, יש לנו חיידקים להודות על המתנה המדעית הזו.

אנזימי הגבלה, הנקראים גם אנדונוקליזות הגבלה, נקשרים ל- DNA ומבקעים את החוט הכפול ויוצרים פיסות DNA קטנות יותר. ישנם שלושה סוגים של אנזימי הגבלה; אנזימי הגבלה מסוג I מזהים רצף DNA וחותכים את החוט באופן אקראי במרחק של יותר מאלף זוגות בסיס מהאתר. אנזימי הגבלה מסוג II, השימושיים ביותר עבור מעבדות ביולוגיה מולקולארית, מזהים וחותכים את גדיל ה- DNA באופן צפוי ברצף ספציפי שאורכו בדרך כלל פחות מעשרה זוגות בסיס. אנזימי הגבלה מסוג III דומים לסוג I, אך אלה חותכים את ה- DNA כשלושים זוגות בסיסים מרצף הזיהוי.

מינים חיידקיים הם המקור העיקרי לאנזימי הגבלה מסחריים. אנזימים אלה משמשים להגנה על תאי החיידק מפני פלישה על ידי DNA זר, כגון רצפי חומצות גרעין המשמשים את הנגיפים לשכפול עצמם בתוך תא מארח. ביסודו של דבר, האנזים יחתוך DNA לחתיכות קטנות בהרבה אשר מהווים סכנה קטנה לתא. האנזימים נקראים על שם המין והזן של החיידקים המייצרים אותו. לדוגמא, אנזים ההגבלה הראשון המופק מזן Escherichia coli RY13 נקרא EcoRI, והאנזים החמישי המופק מאותו המין נקרא EcoRV.

השימוש באנזימי הגבלה מסוג II הוא כמעט אוניברסלי במעבדות ברחבי העולם. מולקולות DNA ארוכות במיוחד וקשה להתנהל כראוי, במיוחד אם חוקר מעוניין רק בגין אחד או שניים. אנזימי הגבלה מאפשרים למדען לחתוך באופן מהימן את ה- DNA לחלקים קטנים בהרבה. יכולת זו לתמרן DNA אפשרה לקדם מיפוי הגבלות ושיבוט מולקולרי.

במעבדה, הידיעה המדויקת היכן נמצאים אתרי הגבלה מסוימים על גדיל DNA היא מועילה ונוחה ביותר. אם ידוע על רצף ה- DNA, ניתן לבצע מיפוי הגבלות באמצעות המחשב, שיכול למפות במהירות את כל רצפי זיהוי האנזים להגבלה. אם רצף ה- DNA אינו ידוע, חוקר עדיין יכול ליצור מפה כללית על ידי שימוש באנזימים שונים לבדם ובשילוב עם אנזימים אחרים כדי לנתק את המולקולה. באמצעות חשיבה דדוקטיבית ניתן ליצור את מפת ההגבלות הכללית. כאשר יש שיבוט גנים, ישנה מפת הגבלה זמינה.

שיבוט מולקולרי הוא טכניקת מעבדה בה חותכים גן ממולקולת DNA מטרה, המופקת בדרך כלל מאורגניזם, על ידי אנזימי הגבלה. לאחר מכן, הגן מוחדר למולקולה הנקראת וקטור, שהם בדרך כלל חתיכות קטנות של DNA מעגלי הנקרא פלסמידים אשר שונו כך שהם נושאים יעד אנזים הגבלה רצפים. הווקטור נבקע באמצעות אנזימי הגבלה, ואז הגן מוחדר לדנ"א המעגלי. אנזים הנקרא DNA ligase יכול אז לבצע רפורמה במעגל כך שיכלול את גן המטרה. לאחר שהגן 'משובט' בצורה כזו, ניתן להכניס את הווקטור לתא חיידקי כך שהגן יכול לייצר חלבון.