רכיבים בסיסיים של HPLC

כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים היא טכניקה לניתוח מעבדה של תערובת. זהו סוג יעיל של כרומטוגרפיה המשתמש בלחץ גבוה, ולא פשוט בכוח המשיכה, כדי להניע דגימה של תערובת דרך עמוד. מוזרקת דגימה ואז משאבה המכילה כמויות לחץ גבוהות מסייעת להעביר את הדגימה לאורך עמוד ארוז, שם היא מופרדת לרכיבים בודדים. הפרדה זו מנותחת על ידי גלאי כדי להניב תוצאות.

על מנת להיות מוזרק ל- HPLC, תחילה יש להמיס מדגם בממס נוזלי קוטבי, רצוי כזה עם ספקטרום HPLC ידוע, כך שניתן יהיה להבדיל בין נתוניו לבין המדגם. התמיסה הנוזלית המכילה את הדגימה מונחת במכשיר ונשלחת לעמודה. המיקום בפועל של אתר ההזרקה תלוי במותג המכשירים. ברוב המקרים תהליך ההזרקה הוא אוטומטי, אך במקרים מסוימים על עובד במעבדה להזריק את הדגימה באמצעות מחט מזרק קטנה.

רכיב המשאבה של יחידת HPLC הוא הכרחי מכיוון שהוא מספק את הלחץ שמניע את הדגימה דרך העמודה. חוזק המשאבה משתנה, אך כוח חזק יכול לייצר לחץ של עד 6,000 psi, או פאונד לאינץ 'מרובע, המופעל לאחר הזרקת הדגימה. זה מאפשר לדגימה לעבור דרך העמודה במהירות וביעילות רבה יותר מאשר אם היה מטפטף באמצעות כוח הכבידה בלבד.

המהירות המוגברת של דגימה שעוברת דרך העמודה באמצעות משאבה מאפשרת להשתמש בסוג שונה של עמוד מאשר אלו המשמשים בכרומטוגרפיית נוזלים פשוטה. חומר האריזה בעמוד יכול להיות בעל גודל חלקיקים קטן בהרבה, מה שמגדיל את שטח הפנים ולכן מסייע לאינטראקציות של הדגימה עם העמוד. רוב עמודי HPLC פועלים באמצעות קוטביות. הדגימה מומסת בממיס קוטבי, והעמודה מורכבת מפחמימנים ברובם לא קוטביים. החלקים הקוטביים של מולקולת הדגימה עוברים דרך הטור מהר מאוד מכיוון שהם מתקשרים בעיקר עם ה- ממס, ואילו המרכיבים הלא קוטביים של המדגם משתהים בעמודה ויוצרים אינטראקציות חלשות עם העמודה רכיבים. לכן, רכיבי המדגם יורדים מהעמודה לפי הקוטב ביותר לרוב הקוטבי.

גלאים משתנים גם בהתאם לסוג מכשיר ה- HPLC בו משתמשים. עם זאת, רובם מתפקדים באותה דרך בסיסית. מקור של אור אולטרה סגול מאיר על רכיבי הדגימה המופרדים כשהם יורדים מהעמוד. רוב התרכובות האורגניות קולטות כמות מסוימת של אור, כך שהן עוברות ליד קרן האור המופעלת, גלאי יכול להרים כמה אור נספג. הגלאי מתעד גם את זמן השמירה של הרכיבים בהתבסס על סדר היציאה מהעמודה. לאחר מכן ניתן לנתח תפוקה זו על בסיס שטח שיא כדי לקבוע את האופי המדויק של רכיבי המדגם.