L'elettroforesi su gel è una tecnica in cui le molecole biologiche vengono separate l'una dall'altra e identificate nella ricerca biologica o nella diagnostica medica. Dal loro sviluppo negli anni '70, queste tecniche sono state preziose nell'identificazione di geni (DNA) e prodotti genici (RNA e proteine) di interesse per la ricerca. Negli ultimi anni sono emerse nuove tecniche che danno maggiore specificità e dettaglio su ciò che sta accadendo nei sistemi viventi. Sebbene queste non abbiano soppiantato le tecniche di elettroforesi e le manipolazioni avanzate possano espandere la fattibilità della tecnica, è importante rendersi conto di ciò che l'elettroforesi su gel può e non può fare.
L'elettroforesi ha un'analisi del campione limitata
L'elettroforesi è specifica per qualunque tessuto tu abbia campionato. Ad esempio, se esegui un Southern blot (un tipo di elettroforesi) su un tampone della guancia, stai guardando i geni dalle cellule epiteliali della tua guancia e da nessun'altra parte del tuo corpo. A volte, questo può essere utile, ma i ricercatori sono spesso interessati a effetti più diffusi.
Tecniche come l'ibridazione in situ (ISH) possono prendere una sezione di tessuto e analizzare l'espressione genica in ogni piccola area di quel campione. Pertanto, i ricercatori possono esaminare ogni area del cervello in un campione con ISH, mentre le tecniche di elettroforesi possono esaminare solo poche aree alla volta.
Le misurazioni dell'elettroforesi non sono precise
L'elettroforesi su gel può separare efficacemente proteine simili con pesi diversi (questa è una tecnica chiamata Western blotting). Può separarli più precisamente attraverso una tecnica nota come elettroforesi 2d; questo è comune in proteomica.
Sfortunatamente, tutte le misurazioni effettuate con questa tecnica sono nella migliore delle ipotesi semi-quantitative. Per ottenere la massa precisa (peso) delle proteine, la spettroscopia di massa deve essere impiegata dopo che la proteina è stata purificata mediante elettroforesi. Inoltre, il confronto delle quantità relative di diverse molecole si basa sulla densità di banda (oscurità) di diversi punti sul gel. Questo metodo ha un certo grado di errore e di solito i campioni vengono eseguiti più volte per ottenere risultati puliti.
È richiesto un campione di partenza sostanziale
L'elettroforesi è una tecnica per isolare e identificare visivamente diverse biomolecole. Questo viene fatto facendo passare una corrente elettrica attraverso il gel per separare molecole cariche di pesi diversi. Se la molecola che ti interessa non è abbastanza comune, la sua banda sarà praticamente invisibile e difficile da misurare.
Il DNA e l'RNA possono essere leggermente amplificati prima di eseguire l'elettroforesi, ma non è pratico farlo con le proteine. Pertanto, è necessario un grande campione di tessuto per eseguire questi test. Ciò può limitare l'utilità della tecnica, specialmente nell'analisi medica. È praticamente impossibile eseguire l'elettroforesi su campioni di una singola cella; citometria a flusso e immunoistochimica sono più comunemente usati per valutare l'espressione cellula per cellula delle proteine. Una tecnica chiamata PCR è eccellente per misurare con precisione piccole quantità di RNA.
Solo alcune molecole possono essere visualizzate
L'elettroforesi è eccellente per separare e identificare biomolecole di medie e grandi dimensioni. Tuttavia, molte delle molecole che i ricercatori desiderano esaminare sono più piccole; piccoli ormoni, neurotrasmettitori e ioni non possono essere misurati mediante elettroforesi. Questo per due motivi: non reagiscono correttamente con la preparazione dell'elettroforesi (di solito una tecnica chiamato SDS PAGE) e, anche se lo facessero, sono troppo piccoli per separarsi correttamente e si precipiterebbero fuori dal fondo il gel. Queste molecole vengono invece misurate con tecniche come i RIAA (radio immunoassays) e gli ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay).
L'elettroforesi è a bassa produttività
L'elettroforesi su gel è generalmente a bassa produttività, il che significa che non produce dati particolarmente rapidamente. Elettroforesi a contrasto, in cui è possibile osservare una piccola manciata di molecole di RNA alla volta, con PCR (reazione a catena della polimerasi), che può valutare contemporaneamente migliaia di campioni. Allo stesso modo, la citometria a flusso può prendere misurazioni da migliaia di singole cellule e rendere complesse correlazioni, mentre l'elettroforesi guarda le cellule in massa e non può fare così bene discriminazioni. La PCR e la citometria a flusso rappresentano rispettivamente processi massicciamente paralleli e seriali ed entrambi superano di gran lunga le capacità dell'elettroforesi di generare dati di ricerca.