Western blot, una tecnica analitica utilizzata per individuare una proteina specifica in un dato campione, impiega la capacità di un enzima o di un anticorpo primario marcato con fluorescenza di legarsi al suo antigene specifico. È un processo in tre fasi che inizia con l'elettroforesi su gel, seguita dalla macchiatura della membrana e dal sondaggio con gli anticorpi. Il rilevamento delle proteine può essere diretto o indiretto, con quest'ultimo che utilizza un anticorpo secondario marcato diretto contro il primario. Sebbene accettato come tecnica di analisi delle proteine di routine, il western blot presenta limiti e vantaggi.
Vantaggio: sensibilità
Uno dei maggiori argomenti a favore del western blot è la sua sensibilità. A causa della sua capacità di rilevare fino a 0,1 nanogrammi di proteine in un campione, la tecnica può teoricamente servire come un efficace strumento diagnostico precoce, rilevando anche la minima risposta immunogenica da un virus o batteri in un paziente campione. Un western blot indiretto si basa ulteriormente su questa sensibilità dalla capacità dell'anticorpo secondario di amplificare l'intensità del segnale rilevato dal sistema di imaging. Una maggiore sensibilità significa che sono necessari meno anticorpi per i test, il che riduce significativamente i costi di laboratorio.
Vantaggio: specificità
La tecnica del western blot deve la sua specificità a due grandi fattori che contribuiscono. Innanzitutto, l'elettroforesi su gel ordina un campione in proteine di diverse dimensioni, carica e conformazione. Questo processo di per sé è un enorme passo avanti verso il rilevamento, poiché le bande formate nel gel forniscono già indizi sulla dimensione della proteina o del polipeptide di interesse. La specificità dell'interazione antigene-anticorpo funge da secondo grande fattore. Poiché gli anticorpi specifici mostrano affinità per proteine specifiche, il processo può rilevare selettivamente una proteina bersaglio anche in una miscela di 300.000 proteine diverse.
Svantaggio: incline a risultati falsi o soggettivi
Nonostante la sua sensibilità e specificità, un western blot può ancora produrre risultati errati. Un risultato falso positivo quando un anticorpo reagisce con una proteina non intenzionale, che è ciò che spesso si verifica quando un paziente sottoposto a test per l'HIV ha la tubercolosi o una serie di parassiti infezioni. Un falso negativo, d'altra parte, può facilmente risultare se le proteine più grandi non hanno tempo sufficiente per trasferirsi correttamente alla membrana. La macchiatura e l'elaborazione improprie spesso producono bande distorte, sbiadite o addirittura multiple, rendendo i risultati dei test soggetti all'interpretazione del tecnico.
Svantaggio: costi elevati e domanda tecnica
Il costo di un western blot è un composto delle grandi spese individuali per anticorpi etichettati, analisti esperti e attrezzature di laboratorio. Un processo delicato, il western blotting richiede precisione in ogni fase per la corretta identificazione dei costituenti di un campione. Un errore minore nella concentrazione del reagente o nel periodo di incubazione può essere disastroso per l'intero processo. Infine, l'attrezzatura necessaria per il rilevamento e l'imaging - sistemi chemiluminescenti, fluorescenti, radioattivi o laser - può essere troppo costosa per l'unità di microbiologia media.