Uno dei modi classici per determinare la concentrazione di microbi in un campione è diluire il campione, far crescere i microbi su piastre e contare le colonie. I microbi placcati crescono da un'unità formante colonia costituita da una o più cellule in una colonia visibile che può essere vista e contata. I batteri sono i microbi più comuni da valutare utilizzando la conta su piastra. I conteggi delle colonie vengono utilizzati per rilevare e contare i microbi nel suolo, nell'acqua e negli alimenti. I protocolli per il conteggio delle colonie enfatizzano un approccio accurato e metodico.
Diluizione dei campioni, placcatura e incubazione
Se semplicemente spalmi un campione di microbi su una piastra di agar, vedrai così tante unità formanti colonie che le singole colonie si fonderanno insieme, rendendole impossibili da contare. Per risolvere questo problema, mescolare il campione in un mezzo liquido, prelevare una piccola quantità di tale miscela e diluirla ulteriormente. Ripeti questo processo da sei a 10 volte. Distribuire la diluizione finale su una piastra di agar e incubarla per 4-7 giorni prima di contare le colonie.
Conteggio manuale
Il trucco principale nel contare le colonie è contare una volta ogni punto della colonia. Un approccio consiste nell'impostare la capsula di Petri su uno sfondo a griglia e contare le colonie in ciascuna cella della griglia, muovendosi secondo uno schema metodico attraverso tutte le celle. Anche la marcatura delle colonie contate sul retro della capsula di Petri può essere un approccio utile. Generalmente, dovrai contare almeno tre piatti; utilizzare solo piastre contenenti da 30 a 300 colonie per fare inferenze robuste, suggerisce la Microbiology Network, un'azienda che fornisce servizi di consulenza a laboratori e produttori. Le piastre con colonie troppo numerose per essere contate o con un numero insufficiente di colonie devono essere ripiastrate da una nuova diluizione.
Conteggio automatizzato
L'errore umano aumenta il tempo necessario per contare manualmente le colonie. Per migliorare sia la precisione che l'efficienza, posizionare la capsula di Petri in un dispositivo automatico di conteggio delle colonie. I contatori di colonie automatizzati acquisiscono un'immagine del piatto, separano le colonie dallo sfondo e quindi utilizzano un algoritmo per contare le colonie sul piatto. Gli algoritmi possono avere difficoltà a differenziare le colonie quando due o più colonie si toccano ai bordi, quindi questa è un'area di sviluppo software in corso.
Rendere il conteggio più complicato
L'accuratezza del calcolo della densità microbica dal conteggio delle colonie presenta alcune limitazioni. Le unità formanti colonie possono essere una singola cellula, una catena di cellule o un intero gruppo di cellule. Il presupposto è che una colonia rappresenti una cellula, quindi le concentrazioni calcolate dai conteggi delle colonie possono essere basse. Microbi diversi necessitano di condizioni di crescita diverse e le colonie sulla piastra rappresentano solo quei microbi che prosperano su quel mezzo di crescita in quelle condizioni di incubazione. Inoltre, il conteggio delle colonie non registra le cellule morte, una considerazione importante quando è necessaria la concentrazione delle cellule nel campione originale.