Il DNA ricombinante (acido desossiribonucleico) è un tipo sintetico di acido nucleico creato collegando il DNA sequenze insieme che non esisterebbero naturalmente in circostanze normali e ambientali condizioni.
Il processo di creazione del DNA ricombinante viene solitamente eseguito con un plasmide ricombinante. Nello specifico, è costituito da un'avanzata procedura di tecnologia del DNA in biologia e genetica nota come clonazione genica. Il DNA ricombinante viene inserito in una cellula, che quindi produce una proteina completamente nuova e viene utilizzata per sintetizzare farmaci, anticorpi o proteine specifiche solo per la ricerca.
Introduzione alla tecnologia del DNA ricombinante
Il DNA di un organismo donatore o di una fonte biologica viene prima estratto dalle cellule e quindi sottoposto a un processo di taglio noto come restrizione enzimatica. Questo genera frammenti di DNA che contengono il gene oi geni di interesse. Questi frammenti possono quindi essere "clonati" (cioè inseriti) o incollati su frammenti dell'organismo ricevente.
Successivamente vengono inseriti in molecole di DNA più grandi (un "plasmide ricombinante"), che vengono inseriti in un batterio e lasciati moltiplicare. Il DNA ricombinante viene quindi recuperato e verificato.
Maggiori informazioni sui pro e contro della tecnologia del DNA ricombinante.
Isolamento del DNA
Il DNA deve prima essere estratto e purificato da altre molecole cellulari, come acidi ribonucleici (RNA), proteine e strutture come le membrane cellulari. Per scopi di clonazione, il DNA viene ottenuto dal nucleo ed è noto come "DNA genomico". Un metodo comune per il DNA l'estrazione avviene per ultracentrifugazione dei componenti cellulari in un gradiente di densità costituito da bromuro di etidio in cesio cloruro.
In alternativa, è possibile utilizzare anche una serie di lavaggi alcalini e tampone salino per recuperare il DNA. Una volta che questo è precipitato e ripulito da tutti gli altri contaminanti indesiderati, il DNA può essere tagliato in frammenti.
Digestione enzimatica di restrizione del DNA
Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano sequenze di DNA molto specifiche; sono usati per creare frammenti di DNA unici. Questo processo garantisce che non vengano generate e non vengano generate sequenze imprecise, errate o indesiderate accidentalmente incorporati nel DNA ricombinante finale, che può provocare sia un fallimento sperimentale che morte cellulare.
Per generare i frammenti di DNA desiderati, viene utilizzato uno specifico enzima singolo (o combinazione di) per tagliare o digerire il DNA. I frammenti vengono quindi purificati mediante elettroforesi su gel, che li separa dal DNA indesiderato. Un metodo di tecnologia del DNA più grezzo prevede semplicemente il taglio meccanico, che strappa i segmenti di DNA più lunghi in quelli più piccoli che possono essere utilizzati per la clonazione.
Legatura del DNA
La legatura è il processo di incollaggio o unione dei frammenti di DNA donatore e ricevente (o vettore) per creare una molecola di DNA plasmidico ricombinante. Idealmente, gli enzimi di restrizione scelti per creare i frammenti sarebbero stati pensati con molta attenzione e progettati in modo tale da consentire a questi pezzi di essere messi insieme come un puzzle.
Per fare ciò, sono preferiti enzimi di restrizione che producono "estremità appiccicose" compatibili, in modo tale che tutti i frammenti compatibili si uniscano naturalmente l'uno all'altro. Altrimenti, l'enzima DNA ligasi può essere utilizzato per unire i segmenti di DNA con legami fosfodiestere.
Replicazione del DNA ricombinante
Il processo di trasformazione o shock termico viene utilizzato per inserire la molecola di DNA ricombinante in una cellula batterica ospite, che può quindi generare molte copie del DNA sintetico. Questi batteri vengono coltivati su piastre di agar, coltivati in speciali brodi batterici e quindi lisati per rilasciare il DNA ricombinante. Infine, il DNA può essere verificato mediante sequenziamento del DNA, esperimenti funzionali e digestione con enzimi di restrizione.
Usi per il DNA ricombinante
La tecnologia del DNA ricombinante viene utilizzata per tutto, dagli esperimenti di laboratorio accademici alla creazione di farmaci. È anche una parte importante del sequenziamento del DNA e dell'identificazione dei geni.
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