Apa Langkah Pertama dalam Reaksi Berantai Polimerase?

Reaksi berantai polimerase, atau PCR, adalah teknik yang memfotokopi satu fragmen DNA menjadi banyak fragmen -- secara eksponensial banyak. Langkah pertama dalam PCR adalah memanaskan DNA sehingga mengalami denaturasi, atau melebur menjadi untaian tunggal. Struktur DNA seperti tangga tali di mana anak tangganya adalah tali dengan ujung magnetis. Magnet terhubung untuk membentuk anak tangga, yang disebut pasangan basa, dan dengan demikian menolak untuk ditarik terpisah. Setiap fragmen DNA melebur menjadi untaian tunggal pada suhu yang berbeda. Memahami bagaimana struktur DNA disatukan oleh bagian-bagian individu DNA akan memberikan wawasan mengapa fragmen DNA yang berbeda meleleh pada suhu yang berbeda dan mengapa suhu tinggi seperti itu diperlukan pada awalnya tempat.

Langkah pertama PCR adalah mencairkan DNA sehingga DNA untai ganda terpisah menjadi DNA untai tunggal. Untuk DNA mamalia, langkah pertama ini biasanya melibatkan panas sekitar 95 derajat Celcius (sekitar 200 Fahrenheit). Pada suhu ini ikatan hidrogen antara pasangan basa A-T dan G-C, atau anak tangga di tangga DNA, pecah, membuka ritsleting DNA untai ganda. Namun, suhunya tidak cukup panas untuk mematahkan tulang punggung gula fosfat yang membentuk untaian tunggal, atau tiang-tiang tangga. Pemisahan lengkap untai tunggal mempersiapkan mereka untuk langkah kedua PCR, yang mendinginkan untuk memungkinkan fragmen DNA pendek, yang disebut primer, untuk mengikat untai tunggal.

Salah satu alasan DNA dipanaskan hingga suhu tinggi 95 derajat Celcius adalah karena semakin panjang untai ganda DNA, semakin ia ingin tetap bersama. Panjang DNA merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi titik leleh yang dipilih untuk PCR pada potongan DNA tersebut. Pasangan basa A-T dan G-C dalam ikatan DNA untai ganda satu sama lain untuk menyatukan struktur untai ganda. Semakin banyak pasangan basa berurutan antara dua untai tunggal telah terikat, semakin tetangga mereka juga ingin mengikat, dan semakin kuat daya tarik antara dua untai menjadi. Ini seperti ritsleting yang terbuat dari magnet kecil. Saat Anda menutup ritsleting, magnet secara alami ingin ritsleting dan tetap ritsleting.

Faktor lain yang mempengaruhi suhu leleh mana yang harus dipilih untuk fragmen DNA yang Anda minati adalah jumlah pasangan basa G-C yang ada dalam fragmen itu. Setiap pasangan basa seperti dua magnet mini yang saling tarik menarik. Sepasang yang terbuat dari G dan C jauh lebih kuat tertarik daripada pasangan A dan T. Dengan demikian sepotong DNA yang memiliki lebih banyak pasangan G-C daripada fragmen lain akan membutuhkan suhu yang lebih tinggi sebelum melebur menjadi untaian tunggal. DNA secara alami menyerap sinar ultraviolet -- tepatnya pada panjang gelombang 260 nanometer -- dan DNA untai tunggal menyerap lebih banyak cahaya daripada DNA untai ganda. Jadi mengukur jumlah cahaya yang diserap adalah cara untuk mengukur seberapa banyak DNA untai ganda Anda telah meleleh menjadi untaian tunggal. Efek “magnetic zipper” pasangan basa G-C dan A-T inilah yang menyebabkan grafik absorbansi cahaya DNA untai ganda diplot terhadap peningkatan suhu menjadi sigmoidal, berbentuk seperti S, dan bukan garis lurus. Kurva S mewakili resistensi kerja tim yang diberikan pasangan basa terhadap panas karena mereka tidak ingin berpisah.

Suhu di mana panjang DNA meleleh menjadi untai tunggal disebut suhu lelehnya, yang dilambangkan dengan singkatan "Tm." Ini menunjukkan suhu di mana separuh DNA dalam larutan telah meleleh menjadi untai tunggal dan separuh lainnya masih dalam untai ganda. untuk m. Temperatur leleh berbeda untuk setiap fragmen DNA. DNA mamalia memiliki kandungan G-C 40%, artinya sisa 60% pasangan basa adalah As dan Ts. Kandungan 40% G-C-nya menyebabkan DNA mamalia meleleh pada suhu 87 derajat Celcius (sekitar 189 Fahrenheit). Inilah sebabnya mengapa langkah pertama PCR pada DNA mamalia adalah memanaskannya hingga 94 derajat Celcius (201 Fahrenheit). Hanya tujuh derajat lebih panas dari suhu leleh dan semua untaian ganda akan benar-benar meleleh menjadi untaian tunggal.