Ketika datang untuk mengukur panjang fragmen DNA, yang jauh lebih kecil dari sel, ahli mikrobiologi membutuhkan trik, dan yang paling nyaman adalah elektroforesis gel. Metode ini bergantung pada fakta bahwa fragmen DNA dibebankan, dan ini merupakan alternatif dari yang lebih mahal metode, seperti kristalografi sinar-X, yang bertanggung jawab atas penemuan struktur heliks ganda dari DNA.
Bagaimana Elektroforesis Gel Bekerja
Karena molekul DNA bermuatan, mereka dipengaruhi oleh arus listrik. Ketika Anda mengaturnya dalam gel netral dan menempatkan arus melintasi gel, molekul bermigrasi ke arah elektroda positif (anoda). Karena molekul DNA dengan ukuran berbeda membawa muatan yang sama, yang lebih kecil bergerak lebih cepat, sehingga proses ini memisahkan molekul menjadi pita yang dapat dibandingkan dengan sampel dengan ukuran yang diketahui.
Prosedur Elektroforesis Dasar
Gel biasanya terbuat dari agarosa, polisakarida yang bila dipanaskan dalam larutan buffer membentuk gel semi padat, sedikit berpori. Di satu ujung, gel membentuk lekukan kecil yang disebut sumur di mana peneliti menempatkan sampel DNA yang diteliti, bersama dengan sampel referensi yang panjangnya diketahui, yang disebut tangga DNA. Panjang fragmen tangga telah ditentukan sebelumnya dengan metode lain, seperti kristalografi sinar-X.
Ketika gel direndam dalam larutan konduktor dan tegangan diterapkan, fragmen mulai bermigrasi melalui gel – yang lebih kecil terlebih dahulu dan yang lebih besar, yang lebih lambat di belakang. Mereka akhirnya membentuk diri mereka menjadi pita seperti spektrum menurut ukuran.
Setelah ini terjadi, peneliti mematikan daya, memasukkan gel dengan pewarna pengikat DVA dan memeriksa spesimen di bawah sinar ultraviolet. Menggunakan tangga sebagai referensi, peneliti dapat menentukan ukuran masing-masing fragmen dalam pita yang terlihat. Hanya pita yang terlihat – fragmen DNA individu terlalu kecil untuk dilihat.
Menentukan Panjang Fragmen yang Tidak Diketahui
Kemungkinan tidak setiap pita dalam sampel berpasangan dengan pita di tangga, jadi untuk menentukan ukuran fragmen yang tidak diketahui ini, para ilmuwan biasanya membuat grafik. Pada sumbu x adalah jarak yang ditempuh oleh setiap pita dalam tangga dalam milimeter, sedangkan pada sumbu y adalah ukuran setiap pita. Ketika titik-titik dihubungkan oleh sebuah kurva, ukuran pita apa pun dapat diekstrapolasi dari kurva setelah mengukur jarak yang ditempuh oleh pita itu dalam milimeter.