Saat bekerja dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), kalibrasi yang baik sangat penting untuk memastikan hasil yang andal dan berkualitas. Kalibrasi yang tepat dari instrumen HPLC dimulai dengan pembuatan standar kalibrasi yang sesuai. Dalam kebanyakan kasus, kalibrasi sebenarnya membutuhkan serangkaian standar peningkatan konsentrasi untuk menghasilkan apa yang dikenal sebagai kurva kalibrasi. Ini adalah garis yang diplot dan persamaan terkait yang menggambarkan hubungan antara konsentrasi bahan kimia yang diuji dan respons detektor HPLC.
Tentukan bahan kimia yang ingin Anda uji untuk menggunakan HPLC ("analit"). Misalnya, Anda mungkin ingin menguji serangkaian minuman ringan untuk kandungan fruktosa, dalam hal ini fruktosa akan menjadi analitnya.
Dapatkan sejumlah bahan kimia analit dengan kemurnian yang sesuai. Biasanya kemurnian harus di atas 99% dan analit harus dibeli dari perusahaan pemasok bahan kimia terkemuka. Dalam kasus fruktosa, misalnya, Anda akan membeli fruktosa murni dari penjual bahan kimia dan bukan dari toko kelontong.
Tentukan konsentrasi analit maksimum dan minimum yang diantisipasi dalam sampel yang ingin Anda uji pada HPLC. Dalam hal minuman ringan, Anda akan memeriksa label minuman dan menentukan kandungan fruktosa terendah dan tertinggi di antara minuman yang akan Anda uji. Ingatlah bahwa sampel awal (minuman ringan) dapat diencerkan atau dimanipulasi selama persiapan untuk analisis (tergantung pada metode HPLC yang digunakan) sehingga konsentrasi analit dalam sampel yang sebenarnya disuntikkan ke HPLC mungkin diubah. Ini adalah konsentrasi analit dalam sampel yang dijalankan pada HPLC yang harus dipertimbangkan.
Tentukan pelarut di mana Anda akan melarutkan analit Anda untuk membuat standar kalibrasi. Pelarut ini harus mampu melarutkan analit dengan baik pada rentang konsentrasi yang relatif luas (setidaknya setinggi sampel yang ingin Anda uji). Selain itu, pelarut ini idealnya harus sangat mirip dengan "fase gerak:" pelarut yang digunakan untuk membawa sampel melalui instrumen HPLC.
Hitung jumlah analit yang diperlukan untuk membuat larutan "standar stok" analit. Ini ditemukan dengan mengalikan konsentrasi yang diperlukan dari standar stok dengan volume yang diinginkan. Konsentrasi analit dalam larutan ini harus setidaknya 10% lebih tinggi dari konsentrasi sampel tertinggi yang diantisipasi. Jika konsentrasi fruktosa yang diantisipasi tertinggi dalam sampel minuman ringan adalah 8 gram/100 mililiter, maka standar stok dapat dibuat dengan konsentrasi 10 gram fruktosa/100 mililiter. Volume yang wajar adalah 500 mililiter, sehingga dibutuhkan 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fruktosa.
Timbang jumlah analit yang diperlukan hingga tingkat presisi yang sesuai. Seringkali nilai bobot dalam gram tepat untuk satu atau dua tempat desimal cocok, tetapi lebih presisi mungkin diperlukan untuk beberapa metode.
Pindahkan analit yang telah ditimbang ke dalam labu ukur dengan volume yang diperlukan dan tambahkan pelarut yang diinginkan sampai tanda isian pada labu. Penggunaan labu volumetrik (bukan gelas ukur, misalnya) meningkatkan ketepatan nilai konsentrasi standar stok. Pastikan bahwa semua analit dipindahkan ke labu; gunakan beberapa pelarut untuk mencucinya, jika perlu.
Buat serangkaian pengenceran standar stok yang bervariasi dengan mentransfer volume standar stok yang diketahui ke dalam labu volumetrik, menggunakan pipet untuk transfer yang akurat, kemudian menambahkan pelarut. Konsentrasi standar terendah harus di bawah sampel terendah yang diantisipasi untuk dianalisis. Dalam contoh minuman ringan, jika konsentrasi fruktosa yang diharapkan terendah dalam sampel adalah 2 gram/100 mL, maka standar 1 gram/100 mL dapat dibuat. Ini akan dibuat dengan pengenceran sepuluh kali lipat dari standar stok. Seri standar harus mencakup total 5 atau 6 konsentrasi, sehingga pengenceran tambahan untuk menghasilkan standar mungkin 3, 5 dan 8 gram fruktosa/mL akan diperlukan. Anda sekarang memiliki serangkaian solusi standar untuk mengkalibrasi HPLC.