Mi a fagyásrepedés és miért hasznos a sejtbiológiában?

A sejtmembránok foszfolipidekből és kapcsolódó vagy beágyazott fehérjékből állnak. A membránfehérjék létfontosságú szerepet játszanak a sejt anyagcseréjében és életében. Nem használhatja a szokásos mikroszkópiát az adhéziós fehérjék, a transzportfehérjék és a fehérje csatornák megjelenítésére vagy jellemzésére a sejtmembránban. Elektronmikroszkóppal és a "fagyasztott törés" nevű technikával, amely szétválasztja a fagyott sejtmembránokat, lehetővé teszi a membrán szerkezetének és a fehérjék szerveződésének vizualizálását a tengeren foszfolipidek. Más módszerek kombinálása a fagyasztásos töréssel nemcsak a különböző sejtmembránok szerkezetének megértésében segít membránfehérjék, de lehetővé teszi a specifikus fehérjék, baktériumok és vírusok.

Folyékony nitrogén alkalmazásával a biológiai szövetmintákat vagy sejteket gyorsan lefagyasztják a sejtalkotók immobilizálása érdekében. A sejtmembránok két réteg foszfolipidből állnak, úgynevezett kétrétegűek, ahol a hidrofób vagy vízgyűlölő lipid farok a membrán belseje és a lipidmolekula hidrofil vagy vízszerető végei kifelé és a sejt. A fagyott mintát mikrotómával repesztik vagy repesztik, amely késszerű eszköz vékony szövetszeletek vágására. Ez azt okozza, hogy a sejtmembrán pontosan szétválik a két réteg között, mivel a hidrofób lipidfarkak közötti vonzalom jelenti a leggyengébb pontot. A repesztést követően a mintán vákuumeljárást hajtanak végre, amelyet "fagyasztott maratásnak" neveznek. A törött felülete a mintát szénnel és platina gőzzel árnyékolják, hogy stabil replika legyen, amely követi a törés körvonalait repülőgép. Savat használnak a replikához tapadó szerves anyagok emésztésére, így a repedt membrán felületének vékony platina héja marad. Ezt a héjat ezután elektronmikroszkóppal elemezzük.

A fagyasztott maratás egy rögzítetlen, fagyasztott és fagyasztással tört biológiai minta vákuumszárítása. A vákuumszárítási eljárás hasonló az élelmiszerboltokban csomagolt és értékesített gyümölcsök és zöldségek fagyasztva szárításához. Fagyasztott maratás nélkül a sejtszerkezet számos részletét homály fedi a jégkristályok. A mély- vagy fagyasztva-marató lépés javítja és kiterjeszti az eredeti fagyasztásos törési módszert, lehetővé téve a sejtmembránok megfigyelését különböző tevékenységek során. Ez lehetővé teszi nemcsak a membránszerkezet, hanem az intracelluláris komponensek elemzését is és részletes szerkezeti információkat nyújt a baktériumokról, vírusokról és a nagy sejtes fehérjékről komplexek.

Az elektronmikroszkóppal a legapróbb organizmusok vagy struktúrák, például baktériumok, vírusok, intracelluláris komponensek és akár fehérjék is több mint egymilliószorosára derülhetnek ki és nagyíthatók. A vizualizáció úgy jön létre, hogy egy ultravékony mintát elektronnyalábbal bombáznak. A két elektronmikroszkópos módszer a pásztázó elektronmikroszkópia vagy SEM és a transzmissziós elektronmikroszkópia vagy TEM. A fagyott törésmintákat rutinszerűen elemezzük a TEM segítségével. A TEM felbontása jobb, mint a SEM, és 3 nanométeres replikákig kínál strukturális információkat.

A fagyasztásos töréses elektronmikroszkópia fejlesztése és alkalmazása azt mutatta, hogy a sejtplazma membránjai lipid kettős rétegekből állnak, és tisztázta, hogy a fehérjék hogyan szerveződnek a sejtmembránokban. A fagyasztásos törés egyedülálló megjelenést kölcsönöz a sejtmembránok belsejének, mert két membránfoszfolipidet hasít és szétválaszt két ellentétes és egymást kiegészítő lapra vagy lapra. Az első fagyasztásos törési gép bevezetése óta eltelt több mint 50 évben a platina replika elkészítése az egyetlen módja a sejtmembránra vonatkozó strukturális információk megszerzésének. A technika megmutatja, hogy specifikus fehérjék lebegnek-e vagy horgonyoznak-e a sejtmembránban, és egyes fehérjék aggregálódnak-e és hogyan. Egy újabb módszer - specifikus fehérjéket megcélzó antitestek felhasználásával - fagyasztásos töréssel kombinálva azonosítja a fehérjéket és azok működését a sejtmembránban.