Gélelektroforézis egy általánosan használt laboratóriumi technika, számos gyakorlati alkalmazással, beleértve a DNS-ujjlenyomatot és a genom szekvenálását. A folyamat elválasztással jár DNS fragmentek elektromos áramot használnak, miközben a molekuláris mozgás sebességét nyomon követik egy szűrőgélen keresztül.
Kék vagy narancssárga nyomkövető festék hozzáadása színtelen DNS-mintákhoz lehetővé teszi a minta megtekintését és információk szerzését arról, hogy a DNS-molekulák hogyan mozognak az elektroforézis során. Az azonosítás a gélen lévő DNS-sávok méretén alapul a molekulák migrációja után.
Hogyan működik a gélelektroforézis
Gélelektroforézis a DNS-fragmenseket elektromos áram segítségével húzza át egy gélen, hogy izolálja és azonosítsa a DNS-molekulákat méret és elektromos töltés alapján. A gélt gyakran készítik agarózpor - poliszacharidból kivonva hínár.
Agarózt adunk a víz és só pufferoldatához, majd az elegyet melegítve és lehűtve porózus gélt kapunk, amely szűrőmátrixként fog működni az elektroforézis során. A gélt ezután egy elektroforézis egységbe helyezzük és vezető pufferoldattal fedjük le
elektromosság.A DNS-t és a töltőanyagokat tartalmazó oldatokat pipettázzuk a gél kis mélyedéseibe, amelyeket el kell készíteni a gél előállítása során. Színezékeksegíteni nekedtisztán látja a mintát hogy az elektroforézis egység negatív elektródja közelében elhelyezkedő géllyukakhoz ad hozzá.
A pozitív elektróda a másik végén helyezkedik el. A DNS-fragmensek ismert standardját helyezzük az első kútba, amely összehasonlítási és azonosítási célokra létrehoz egy létra DNS-sávot.
A DNS-molekulák foszfátváza negatív töltést ad a DNS-nek. Az ellentétek vonzzák, így a DNS-molekulák vonzódnak a pozitív elektródához, és elektromos áram bekapcsolásakor mozogni, vagy „vándorolni” kezdenek.
A kisebb méretű DNS-fragmensek gyorsabban utaznak, mint a nagyobbak, mert kevesebb ellenállással találkoznak, amikor a gél porózus mátrixán keresztül vándorolnak. Hasonló méretű DNS-fragmensek DNS-sávokat képeznek a gélben.
A festék céljának és fontosságának betöltése
A DNS színtelen, ezért hozzáadjuk nyomkövető festékek egy minta segít határozza meg a mozgás sebességét különböző méretű fehérjemolekulák a gélben az elektroforézis során. A DNS-mintával együtt mozgó töltőfestékek például bróm-fenolkék és xilol-cianol.
A választott festék nem lehet reaktív, és nem változtatja meg a DNS-t. A bróm-fenol kék egy olyan festék, amelyet kb. 400 bázispárt tartalmazó kisebb méretű DNS-szálak nyomon követésére használnak, míg a nagyobb, akár 8000 bázispárral rendelkező DNS-szálaknál jobb a xilol-cianol. A választott festék nem lehet reaktív, és nem változtatja meg a DNS-t.
A glicerin szerepe az agaróz gél elektroforézisben
Amikor elkészíti a DNS mintáját elektroforézis, hozzá kell adnia glicerint és vizet a töltőanyagokkal együtt. A glicerin nehéz, szirupos anyag, amely nagyobb sűrűséget ad a DNS-mintának, mielőtt a géllap egyik végén lévő lyukakba illesztenék.
Glicerin nélkül a DNS-minta szétszóródna, ahelyett, hogy süllyedne, és egy réteget képezne a kútban, mint azt a DNS-létra kialakításához kellene.
A festék nyomon követése az SDS PAGE-ban
A nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS PAGE) egy olyan technika, amely alkalmas a fehérjék és az aminosavak szétválasztására, amelyek kisebbek és összetettebbek, mint a lineáris DNS-molekulák. Az elektroforézishez agarózgél helyett poliakrilamidot (SDS PAGE gélt) használnak.
Bróm-fenol-kéket (BPB) adunk a mintapufferhez a-ként nyomkövető festék amely a fehérjék elválasztásának azonos irányába mozog és elhatárolja azok élét.
A DNS-kötő festék szerepe
DNS-kötő festék, mint pl narancs színű etidium-bromid hozzáadható gélhez vagy elektroforézis pufferhez. Ahogy a neve is mutatja, a festék a DNS-molekulához kapcsolódik.
Ennek a mutagén festéknek a kezelésénél nagy körültekintéssel kell eljárni, mert a bőrsejtekben képes kötődni a DNS-hez. A nyomkövető festékektől eltérően az etidium-bromid fluoreszkál fényesen alatt UV fény, láthatóvá téve a DNS-sávokat.
