A sejt genetikai terve genetikai anyagában vagy DNS-ében van kódolva. Mivel a DNS soha nem hagyja el a sejt magját, annak érdekében, hogy ez az információ a citoplazmába kerüljön, ahol más a fehérjék és a biokémiai komponensek rezidensek, először át kell írni a DNS-t messenger RNS-be (mRNS vagy poli (A) RNS). Ez az mRNS ezután fehérjévé válik, amelyek a sejt számos funkcióját ellátják. A nagyon ritka mRNS-ek kimutatásához vagy számszerűsítéséhez, mikrohullámú próbák készítéséhez vagy komplementer DNS-molekulák könyvtárainak felépítéséhez az mRNS-t el kell különíteni. Azonban a teljes RNS (azaz a sejtben található összes RNS) extrakció és az azt követő mRNS izolálás nem zárja ki egymást; az előbbit el kell végezni az mRNS kivonása érdekében.
TRIzol homogenizálás: A teljes RNS magában foglalja az összes mRNS-t, transzfer RNS-t, riboszomális RNS-t és egyéb nem kódoló RNS-ek. Ezeknek a többi sejtkomponenstől való elkülönítéséhez a sejtet először felnyitják, hogy felszabaduljon tartalmát. Ez a sejtek reszuszpendálásával történik, centrifugálással (nagy sebességgel centrifugálva) TRIzol Reagensben (Life Technologies). A TRIzol más verziói (például az Ambion TRI Reagense) hasonlóan működnek.
Teljes RNS-izoláció: Centrifugálási sorozatot használunk a sejt különböző komponenseinek (fehérjék, DNS, RNS) rétegekre vagy fázisokra történő szétválasztására a szuszpenzióban. A felső, sárga színű fázis zsírból áll, és eldobható. A kívánt fázis vörösre színezett, tartalmazza az összes RNS-t és megmarad. Fenol-kloroformos extrakció és izopropanol és etanol alkalmazásával végzett alkoholmosások sorozatának elvégzése után az RNS-t granulálhatjuk mRNS-izolálásra. Adjon hozzá RNáz inhibitorokat, hogy megakadályozza, hogy ez az enzim lebontja a teljes RNS-t.
mRNS kivonás: Gyakran használunk kitet az mRNS-ek elkülönítésére, mivel a házi laboratóriumi protokollok nem generálnak nagy mennyiséget nagymértékben tisztított mRNS-ek. A kereskedelmi készletek tartalmazzák az Invitrogen FastTrack 2.0 vagy az Ambion's Poly (A) Pure mRNS izolálását Készlet. Ezek az alapvető lépések közösek az ilyen készleteknél:
d) Centrifugáljuk ezt a mintát, és nyerjük ki a felülúszót, amelyet többször mossunk a készletekben található kötő és alacsony sótartalmú pufferek sorozatában.
Hivatkozások
- "cDNS könyvtárprotokollok?"; Ian G. Cowell és Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transzkripciós és fordítási protokollok?"; Martin J. Tymms; 1995
Tippek
- Az összes reagenst, sejtet és RNS-t hidegben kell tartani, jégbe merítve. Ez megakadályozza az RNS lebontását bármely más enzim által, amely felszabadul a homogenizációs folyamat során.
Figyelmeztetések
- Az olyan reagensek, mint a TRIzol, mérgezőek, és nem érintkezhetnek a bőrrel vagy a nyálkahártyákkal. A reagens kezelésekor mindig tartsa be a biztonságos laboratóriumi protokollokat.
A szerzőről
Palmer Owyoung a Kaliforniai Egyetemen (San Diego) a nemzetközi üzletben szerzett diplomát és a A Santa Barbara-i Kaliforniai Egyetemen szerzett szociológiai művészeti alapképzést, és képzett molekula biológus. 2006 óta szabadúszó író. Az írás mellett főállású Forex-kereskedő és internetes marketingszakember.
Fotók
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images
