Moguće je klonirati cijele organizme poput ovce Dolly, ali kloniranje DNA je drugačije. Za izradu koristi tehnike molekularne biologije identične kopije sljedova DNA ili pojedinačnih gena.
Korištenjem metoda genetskog inženjeringa identificiraju se i izoliraju segmenti genetskog koda DNA. Kloniranje DNA zatim kopira nukleinske kiseline sekvence u segmentima.
Dobivene identične kopije mogu se koristiti za daljnja istraživanja ili za biotehnološke primjene. Kopirani gen često kodira protein koji može biti dio medicinskih tretmana. DNA tehnologija uključujući Kloniranje DNA podržava razumijevanje kako geni djeluju i kako genetski kod ljudi utječe na funkcioniranje tijela.
DNA kloniranje: definicija i pregled procesa
Kloniranje DNA postupak je molekularne biologije izrade identičnih kopija segmenata DNA smještenih u kromosomima koji sadrže genetski kod naprednih organizama.
Proces generira velike količine ciljane sekvence DNA. Cilj kloniranja DNA je proizvesti same ciljne sekvence DNA ili proizvesti proteine kodirane u ciljnim sekvencama.
Pozvane su dvije metode korištene u kloniranju DNA vektor plazmida i lančana reakcija polimeraze (PCR). U vektor plazmida metodom, DNA lance se režu pomoću restrikcijski enzimi kako bi se dobili fragmenti DNA, a rezultirajući segmenti se umetnu u klonirajuće vektore zvane plazmidi za daljnje umnožavanje. Plazmidi se smještaju u bakterijske stanice koje zatim proizvode DNA kopije ili kodirane proteine.
U PCR metoda, segment DNA lanaca koji se duplicira označen je enzimima tzv početnice. Enzim polimeraze pravi kopije označenog dijela DNA lanca. Ova metoda ne koristi restrikcijske enzime i može proizvesti kloniranu DNA iz malih uzoraka. Ponekad se dvije metode DNK tehnologije koriste zajedno kako bi se u cjelokupnu reakciju ugradile najbolje osobine svake od njih.
Metoda vektora plazmida
Vektor metode odnosi se na plazmid koji se koristi za zadržavanje ciljanog segmenta DNA koji se klonira. Plazmidi su mali kružni pramenovi ne-kromosomska DNA nalazi se u mnogim organizmima, uključujući bakterije i viruse.
Bakterijski plazmidi su vektor koji se koristi za umetanje ciljnog segmenta DNA u bakterijske stanice radi daljnjeg umnožavanja.
Odabir i izolacija ciljne DNA: Prije nego što započne postupak kloniranja DNA, moraju se identificirati sekvence DNA, posebno počeci i krajevi DNA segmenata.
Takve DNA sekvence mogu se pronaći korištenjem postojeće klonirane DNA s poznatim sekvencama ili proučavanjem proteina proizvedenog ciljnom DNA sekvencom. Jednom kad je slijed poznat, mogu se koristiti odgovarajući restrikcijski enzimi.
Rezanje ciljne DNA restrikcijskim enzimima: Restrikcijski enzimi odabrani su da traže DNA kod na početku i na kraju ciljnih sekvenci.
Kada restrikcijski enzimi pronađu poseban kodirani slijed baznih parova koji se nazivaju restrikcijska mjesta, oni vežu se za DNK na tom mjestu i navijaju se oko molekule DNK, raskidajući nasukati. Izrezani DNA segmenti koji sadrže ciljani slijed sada su dostupni za umnožavanje.
Odabir vektora plazmida i umetanje ciljne DNA: Prikladni plazmid idealno sadrži iste DNA kodirajuće sekvence kao i DNA lanac iz kojeg je odrezana ciljana DNA. Kružni DNA lanac plazmida reže se istim restrikcijskim enzimima koji su korišteni za rezanje ciljne DNA.
A Enzim DNA ligaze koristi se za promicanje povezivanja DNA segmenata, a krajevi ciljnog DNA segmenta povezuju se s presječenim krajevima plazmidne DNA. Ciljna DNA sada čini dio kružne lančane plazmidne DNA.
Umetanje plazmida u bakterijsku stanicu: Jednom kad plazmid sadrži sekvencu DNA koju treba klonirati, stvarno kloniranje može se dogoditi pomoću postupka tzv bakterijska transformacija. Plazmidi su umetnuti u bakterijsku stanicu kao što je E. coli, a stanice s novim DNA segmentima počet će stvarati kopije i odgovarajuće proteine.
U bakterijskoj transformaciji, stanice domaćini i plazmidi inkubiraju se zajedno na tjelesnoj temperaturi oko 12 sati. Stanice apsorbiraju neke od plazmida i tretiraju ih kao vlastiti DNA plazmida.
Skupljanje klonirane DNA i proteina: Većina plazmida koji se koriste za kloniranje DNA imaju geni otpornosti na antibiotike ugrađeni u njihov DNK. Kako bakterijske stanice apsorbiraju nove plazmide, one postaju otporne na antibiotike.
Kada se kultura tretira antibioticima, opstaju samo one stanice koje su apsorbirale nove plazmide. Rezultat je čista kultura bakterijskih stanica s kloniranom DNA. Tada se DNK može prikupiti ili proizvesti odgovarajući protein.
Metoda PCR (lančana reakcija polimeraze)
The PCR metoda je jednostavnija i kopira postojeću DNA na mjestu. Ne zahtijeva rezanje restrikcijskim enzimima ili umetanje plazmidDNA sekvence. To ga čini posebno pogodnim za kloniranje uzoraka DNA s ograničenim brojem DNA lanaca. Iako metoda može klonirati DNA, ne može se koristiti za proizvodnju odgovarajućeg proteina.
Otkrivanje DNA lanaca: DNA u kromosomima čvrsto je namotana u strukturu dvostruke zavojnice. Zagrijavanje DNA na 96 Celzijevih stupnjeva u procesu tzv denaturacija čini da se molekula DNA odmota i razdvoji u dva lanca. Ovo razdvajanje je potrebno jer se odjednom može klonirati samo jedan lanac DNA.
Odabir početnih slojeva: Kao i kod kloniranja DNA plazmidnih vektora, sekvence DNA koje se kloniraju moraju se identificirati s posebnim naglaskom na početke i krajeve DNA segmenata. Primeri su enzimi koji se vežu za određene sekvence DNA koda i oni moraju biti odabrani kako bi obilježili ciljne segmente DNA. Pravi početnici pričvrstit će se na sekvence molekula DNA kako bi označili početke i krajeve ciljnih segmenata.
Žar reakcije na vezanje početnih slojeva: Pozvano je hlađenje reakcije na oko 55 Celzijevih stupnjeva žarenje. Kako se reakcija hladi, početnice se aktiviraju i vežu za DNA lanac na svakom kraju ciljanog DNA segmenta. Primeri djeluju samo kao markeri, a DNA lanac ne mora se rezati.
Izrada identičnih kopija ciljnog segmenta DNA: U procesu tzv produženje, reakciji se dodaje enzim TAQ polimeraze osjetljiv na toplinu. Reakcija se zatim zagrije na 72 Celzijeva stupnja, aktivirajući enzim. Aktivni enzim DNA polimeraza veže se na početnice i kopira DNA sekvencu između njih. Početni postupak sekvenciranja i kloniranja DNA je završen.
Povećanje prinosa klonirane DNA: Početni postupak žarenja i produženja stvara relativno malo kopija dostupnih segmenata lanca DNA. Da bi se povećao prinos dodatnom replikacijom DNA, reakcija se ponovno ohladi da bi se reaktivari ponovno aktivirali i pustili da se vežu za druge DNA lance.
Zatim ponovnim zagrijavanjem reakcije ponovno se aktivira enzim polimeraza i stvara se više kopija. Ovaj se ciklus može ponoviti 25 do 30 puta.
Zajedno korištenje plazmidnih vektora i metoda kloniranja PCR DNA
Metoda vektorskog plazmida oslanja se na obilnu početnu opskrbu DNA za rezanje i umetanje u plazmide. Premalo izvorne DNA rezultira s manje plazmida i polaganim početkom klonirane proizvodnje DNA.
PCR metoda može proizvesti veliku količinu DNA iz nekoliko izvornih DNA lanaca, ali budući da DNA nije implantirana u bakterijsku stanicu, proizvodnja proteina nije moguća.
Za proizvodnju proteina kodiranog u fragmentima DNA koji se kloniraju iz malog početnog uzorka DNA, dvije metode mogu se koristiti zajedno, a mogu i nadopunjuju se. Prvo se PCR metoda koristi za kloniranje DNA iz malog uzorka i stvaranje mnogih kopija.
Tada se PCR proizvodi koriste plazmidnom vektorskom metodom za implantaciju proizvedene DNA u bakterijske stanice koje će proizvesti željeni protein.
Primjeri DNA kloniranja za biotehnologiju
Molekularna biologija koristi kloniranje gena i replikaciju DNA u medicinske i komercijalne svrhe. Bakterije s kloniranim DNA sekvencama koriste se za proizvodnju lijekova i zamjenu tvari koje ljudi s genetskim poremećajima ne mogu sami proizvesti.
Tipične namjene uključuju:
- Gen za ljudski inzulin kloniran je u bakterije koje potom proizvode inzulin koji koriste dijabetičari.
- Aktivator plazminogena u tkivu proizvodi se od klonirane DNA i koristi se za pomoć spriječiti stvaranje krvnih ugrušaka.
- Ljudski hormon rasta mogu se proizvesti i primijeniti ljudima koji to ne mogu sami proizvesti.
Biotehnologija također koristi kloniranje gena u poljoprivredi kako bi stvorila nove karakteristike u biljkama i životinjama ili poboljšala postojeće osobine. Kako se klonira više gena, broj mogućih primjena eksponencijalno se povećava.
Primjeri DNA kloniranja za istraživanje
Molekule DNA čine mali dio materijala u živoj stanici i teško je izolirati utjecaje mnogih gena. Metode kloniranja DNA dostavljaju velike količine određene sekvence DNA za proučavanje, a DNA proizvodi proteine baš kao što je to učinila u izvornoj stanici. Kloniranje DNA omogućuje izolirano proučavanje ove operacije za različite gene.
Tipična istraživanja i primjene DNK tehnologije uključuju ispitivanje:
- Funkcija gena.
- Mutacije gena.
- Ekspresija gena.
- Genski proizvodi.
- Genetske mane.
Kada se klonira više DNA sekvenci, lakše je pronaći i klonirati dodatne sekvence. Postojeći klonirani segmenti DNA mogu se koristiti za utvrđivanje odgovara li novi segment starom i koji su dijelovi različiti. Tada je prepoznavanje ciljne sekvence DNA brže i preciznije.
Primjeri DNA kloniranja za gensku terapiju
U genska terapija, klonirani gen predstavljen je stanicama organizma čiji je prirodni gen oštećen. Vitalni gen koji proizvodi protein potreban za određenu funkciju organizma mogao bi biti mutiran, promijenjen zračenjem ili pod utjecajem virusa.
Kad gen ne radi ispravno, stanici nedostaje važna tvar. Genska terapija pokušava zamijenite gen kloniranom verzijom koja će proizvesti potrebnu tvar.
Genska terapija i dalje je eksperimentalna, a malo je pacijenata izliječeno tehnikom. Problemi leže u identificiranju pojedinog gena koji je odgovoran za zdravstveno stanje i isporuci mnogih kopija gena u prave stanice. Kako je kloniranje DNA postajalo sve raširenije, genska terapija primjenjivala se u nekoliko specifičnih situacija.
Nedavne uspješne aplikacije uključuju:
- Parkinsonova bolest: Koristeći virus kao vektor, gen povezan s Parkinsonovom bolešću ubrizgan je u srednji mozak pacijenata. Pacijenti su iskusili poboljšane motoričke sposobnosti bez ikakvih štetnih nuspojava.
- Nedostatak adenozin deaminaze (ADA): Genetski imunološki poremećaj liječen je uklanjanjem matičnih stanica krvi pacijenata i umetanjem ADA gena. Kao rezultat toga, pacijenti su mogli proizvesti barem dio vlastitog ADA.
- Hemofilija: Osobe s hemofilijom ne proizvode specifične proteine koji pomažu u zgrušavanju krvi. Gen za proizvodnju jednog od nedostajućih proteina umetnut je u stanice jetre pacijenata. Pacijenti su proizveli proteine i smanjili su se incidenti s krvarenjem.
Genska terapija jedna je od najperspektivnijih primjena kloniranja DNA, ali druge nove namjene vjerojatno će se razmnožavati kako se proučava više DNA sekvenci i određuje njihova funkcija. Kloniranje DNA daje sirovinu za genetski inženjering u potrebnim količinama.
Kada je uloga gena poznata i njihova ispravna funkcija može se osigurati zamjenom neispravnih geni, mnoge kronične bolesti, pa čak i rak mogu se napadati i liječiti na genetskoj razini pomoću DNA tehnologija.
Povezani sadržaj:
- Karakteristike kolonije E.Coli (Escherichia Coli)
- RNA: Definicija, funkcija, struktura