U molekularnoj biologiji može biti dobar odabir pufera i priprema za različite korake izolacije DNA razlika između prijelaza na ekspresiju proteina ili otvaranja drugog maksi-preparata za početak nad. Unatoč svojoj presudnoj važnosti, međuspremnici su često upravo to - recepti napisani bez objašnjenja ili obrazloženja različitih komponenata. Jedan od takvih pufera je pufer glukoza-tris-EDTA ili GTE.
Za što se koristi GTE?
GTE se koristi za resuspendiranje peleta bakterijskih stanica prije liziranja (otvaranja) stanica i sakupljanja plazmidne DNA iznutra. Lizozim, koji omekšava stanične membrane, često se dodaje zajedno s GTE puferom. Postizanje homogene suspenzije cijelih stanica tijekom ovog koraka, tako da naknadno dodana otopina za lizu može doći do svih stanica, ključno je za postizanje dobrih prinosa DNA. GTE je dizajniran da to učini, a istovremeno osigurava stabilno okruženje za DNA.
Glukoza za osmolarnost
50mM (milimolarni) glukozni šećer dodaje se u GTE pufer kako bi se održala osmolarnost tamo gdje je koncentracija otopljene tvari izvan stanica blizu one unutar stanica. To sprječava prevremenu lizu stanica, što može dovesti do nižih prinosa DNA uslijed agregacije i razgradnje. Ostale komponente pufera također doprinose osmolarnosti otopine, ali glukoza, budući da nije elektrolit, dobar je izbor jer ne ometa pufer otopine Svojstva.
Tris za pH stabilnost
Tris je kratki naziv za tris (hidroksimetil) aminometan, što je vrlo čest pH pufer. U slučaju GTE pufera, pufer se dodaje kisela sol (Tris-HCl) u koncentraciji od 25 mM. To održava pH otopine na gotovo fiziološkom 8,0, idealnom pH za sprječavanje kisele hidrolize (razgradnje) plazmidne DNA i neželjenih nuspojava ostalih komponenata stanice.
EDTA sprječava razgradnju DNA
EDTA ili etilendiamintetraoctena kiselina hvata ili "kelira" metalne ione iz otopine, sprječavajući ih da sudjeluju u neželjenim nuspojavama. U GTE pufer dodaje se EDTA na 10 mM. Njegova je primarna svrha u puferu za zaokruživanje slobodnog cinka, magnezija i kalcija, čime se sprječava razgradnja DNA određenim putovima koji zahtijevaju te metale.
Neki važni savjeti
Neka vaš GTE pufer bude hladan i napravite ga u malim količinama kako biste spriječili rast neželjenih bakterija u njemu. Šećer i kontrolirani pH čine odličan medij za rast. Uvijek koristite pročišćenu vodu. Voda iz slavine može imati višak metalnih iona iz cijevi, što može nadvladati sposobnost EDTA da uhvati. Ako sumnjate na prisutnost ometajuće RNA u vašem uzorku, dodajte RNazu A u količini od 100 mikrograma po mililitru u svoj GTE pufer kako biste uklonili problem.