Nukleotidi su kemijski gradivni blokovi života i nalaze se u DNK živih organizama. Svaki nukleotid sastoji se od šećer, fosfat i a baza koja sadrži dušik: adenin (A), timin (T), citozin (C) i gvanin (G). Specifični redoslijed ovih nukleotidnih baza određuje koje će proteine, enzime i molekule stanica sintetizirati.
Određivanje reda ili slijeda nukleotida važno je za proučavanje mutacije, evolucija, progresija bolesti, genetsko testiranje, forenzička istraga i medicina.
Genomika i sekvenciranje DNA
Genomika je proučavanje DNA, gena, interakcija gena i utjecaja okoline na gene. Tajna razotkrivanja složenog unutarnjeg djelovanja gena jest u mogućnosti identificirati njihovu strukturu i mjesto na kromosomima.
Nacrt živih organizama određen je redoslijedom (ili redoslijedom) parova baza nukleinske kiseline u DNA. Kada se DNA replicira, adenin se udružuje s timinom, a citozin s gvaninom; uzimaju se u obzir neusklađeni parovi mutacije.
Budući da je dvostruka zavojnica deoksiribonukleinska kiselina (DNA) molekula konceptualizirana je 1953. godine, napravljena su dramatična poboljšanja na polju genomike i sekvenciranja DNA velikih razmjera. Znanstvenici marljivo rade na primjeni ovog novog znanja na individualizirano liječenje bolesti.
Istodobno, tekuće rasprave omogućuju istraživačima da ostanu ispred etičkih implikacija takvih tehnologija koje brzo eksplodiraju.
Definicija sekvenciranja DNA
Sekvenciranje DNA postupak je otkrivanja slijeda različitih nukleotidnih baza u isječcima DNA. Sekvenciranje cijelih gena omogućuje usporedbu kromosoma i genoma prisutnih u istoj i različitim vrstama.
Mapiranje kromosoma korisno je za znanstvena istraživanja. Analizirajući mehanizme i strukturu geni, aleli i kromosomske mutacije u molekulama DNA sugeriraju nove načine liječenja genetskih poremećaja i zaustavljanja rasta kancerogenog tumora, na primjer.
Sekvenciranje DNA: rana istraživanja
Metode sekvenciranja DNA Fredericka Sangera uvelike napredovao na području genomike počevši od 1970-ih. Sanger se osjećao spremnim za rješavanje sekvenciranja DNA nakon uspješnog sekvenciranja RNA tijekom proučavanja inzulina. Sanger nije prvi znanstvenik koji se bavio sekvenciranjem DNA. Međutim, njegove pametne metode sekvenciranja DNA - razvijene u tandemu s kolegama Bergom i Gilbertom - donijele su Nobelovu nagradu 1980.
Najveća Sangerova ambicija bila je sekvenciranje velikih razmjera, cijelih genoma, ali sekvenciranje u minuskuli parovi baza bakteriofaga problijedjeli su u usporedbi sa sekvenciranjem 3 milijarde parova baza čovjeka genom. Unatoč tome, naučiti kako sekvencirati čitav genom niskog bakteriofaga bio je glavni korak ka spajanju cijelog genoma ljudskih bića. Budući da se DNA i kromosomi sastoje od milijuna parova baza, većina metoda sekvenciranja razdvaja DNA u male niti, a zatim se DNA segmenti slažu; samo treba vremena ili brzih, sofisticiranih strojeva.
Osnove sekvenciranja DNA
Sanger je znao potencijalnu vrijednost svog rada i često je surađivao s drugim znanstvenicima koji su dijelili njegove interese u DNK, molekularna biologija i nauka o životu.
Iako su spore i skupe u usporedbi s današnjim tehnologijama sekvenciranja, Sangerove metode sekvenciranja DNA bile su tada hvaljene. Nakon pokušaja i pogrešaka, Sanger je pronašao tajni biokemijski "recept" za odvajanje niti DNA, stvarajući više DNA i identificirajući redoslijed nukleotida u genomu.
Kvalitetni materijali mogu se lako kupiti za upotrebu u laboratorijskim studijama:
- DNA polimeraza je enzim potreban za stvaranje DNA.
- DNA primer govori enzimu odakle početi raditi na lancu DNA.
- dNTP-ovi su organske molekule sastavljene od deoksiriboznog šećera i nukleozidnih trifosfata - dATP, dGTP, dCTP i dTTP - koji okupljaju proteine
- Završni lanci su nukleotidi boje boje, koji se nazivaju i terminatorski nukleotidi za svaku bazu - A, T, C i G.
Metode sekvenciranja DNA: Sangerove metode
Sanger je smislio kako DNK izrezati na male segmente pomoću enzima DNA polimeraze.
Zatim je iz predloška izradio više DNA i u novu DNK umetnuo radioaktivne tragove kako bi razgraničio dijelove odvojenih niti. Također je prepoznao da enzim treba temeljni premaz koji se može vezati za određeno mjesto na lancu matrice. 1981. godine Sanger je ponovno ušao u povijest otkrivši genom od 16 000 baznih parova mitohondrijske DNA.
Još jedan uzbudljiv razvoj bila je metoda sačmarice koja je nasumično uzorkovala i sekvencirala do 700 osnovnih parova odjednom. Sanger je također poznat po svojoj upotrebi metode dideoksi (dideoksinukleotid) koja uvodi nukleotid koji završava lanac tijekom sinteze DNA kako bi obilježio dijelove DNA za analizu. Dideoksinukleotidi remete aktivnost DNA polimeraze i sprečavaju stvaranje nukleotida na nizu DNA.
Koraci sekvenciranja DNA
Temperatura se mora pažljivo prilagođavati tijekom cijelog postupka sekvenciranja. Prvo se kemijske tvari dodaju u cijev i zagrijavaju kako bi se razmotalo (denaturiralo) dvolančano Molekula DNA. Tada se temperatura ohladi, dopuštajući temeljnom sloju da se veže.
Zatim se temperatura povisuje kako bi se potaknula optimalna aktivnost DNA polimeraze (enzima).
Polimeraza obično koristi normalne dostupne nukleotide, koji se dodaju u višoj koncentraciji. Kad polimeraza dođe do nukleotida povezanog s bojom koji završava lancem, polimeraza se zaustavlja i lanac tamo završava, što objašnjava zašto se obojeni nukleotidi nazivaju "završetak lanca" ili "Terminatori".
Proces se nastavlja puno, puno puta. Na kraju je nukleotid povezan s bojom postavljen na svaki pojedini položaj sekvence DNA. Tada elektroforeza u gelu i računalni programi mogu prepoznati boje boja na svakom od DNA lanaca i shvatiti cjelokupni slijed DNA na temelju boje, položaja boje i duljine niti.
Napredak u tehnologiji sekvenciranja DNA
Sekvenciranje velike propusnosti - općenito nazivano sekvenciranje sljedeće generacije - koristi nova dostignuća i tehnologije za sekvenciranje nukleotidnih baza brže i jeftinije nego ikad prije. Stroj za sekvenciranje DNA može lako podnijeti velike dijelove DNA. Zapravo se čitavi genomi mogu napraviti za nekoliko sati, umjesto godina, pomoću Sangerovih tehnika sekvenciranja.
Metode sekvenciranja sljedeće generacije mogu se nositi s analizom DNA velikog volumena bez dodatnog koraka pojačavanja ili kloniranja kako bi se dobilo dovoljno DNA za sekvenciranje. Strojevi za sekvenciranje DNA istodobno izvode više reakcija sekvenciranja, što je jeftinije i brže.
U osnovi, nova tehnologija sekvenciranja DNA pokreće stotine Sangerovih reakcija na malom, lako čitljivom mikročipu koji se zatim pokreće kroz računalni program koji sastavlja niz.
Tehnika čita kraće fragmente DNA, ali je i dalje brža i učinkovitija od Sangerovih metoda sekvenciranja, pa se čak i veliki projekti mogu brzo dovršiti.
Projekt ljudskog genoma
The Projekt ljudskog genoma, završena 2003. godine, jedna je od najpoznatijih studija sekvenciranja do danas. Prema članku iz 2018. u Vijesti o znanosti, ljudski genom sastoji se od približno 46.831 gena, što je bio strahovit izazov za slijed. Vrhunski znanstvenici iz cijelog svijeta proveli su gotovo 10 godina surađujući i savjetujući se. Vodio Nacionalno istraživanje ljudskog genoma
Institut, projekt je uspješno mapirao ljudski genom koristeći kompozitni uzorak uzet od anonimnih darivatelja krvi.
Projekt humanog genoma oslanjao se na metode sekvenciranja bakterijskih umjetnih kromosoma (BAC) za mapiranje baznih parova. Tehnika je koristila bakterije za kloniranje fragmenata DNA, što je rezultiralo velikim količinama DNA za sekvenciranje. Klonovi su zatim smanjeni, stavljeni u stroj za sekvenciranje i sastavljeni u dijelove koji predstavljaju ljudsku DNA.
Ostali primjeri sekvenciranja DNA
Nova otkrića u genomici duboko mijenjaju pristupe prevenciji, otkrivanju i liječenju bolesti. Vlada je za istraživanje DNK uložila milijarde dolara. Provođenje zakona oslanja se na DNK analizu za rješavanje slučajeva. Kompleti za DNK testiranje mogu se kupiti za kućnu upotrebu kako bi se istražilo pretke i identificirale varijante gena koje mogu predstavljati zdravstveni rizik:
- Genomska analiza podrazumijeva usporedbu i suprotstavljanje sljedova genoma mnogih različitih vrsta u područjima i kraljevstvima života. DNK sekvenciranje može otkriti genetske obrasce koji bacaju novo svjetlo kad su određene sekvence uvedene evolucijski. Preci i migracije mogu se pratiti putem DNK analize i usporediti s povijesnim zapisima.
- Napredak u medicini događaju se eksponencijalno brzo, jer gotovo svaka ljudska bolest ima genetsku komponentu. DNK sekvenciranje pomaže znanstvenicima i liječnicima da shvate kako više gena djeluje međusobno i s okolinom. Brzo sekvenciranje DNK novog mikroba koji uzrokuje izbijanje bolesti može pomoći u identificiranju učinkovitih lijekova i cjepiva prije nego što problem postane ozbiljan problem javnog zdravstva. Varijante gena u stanicama raka i tumorima mogu se sekvencirati i koristiti za razvoj individualiziranih genskih terapija.
- Forenzika aplikacije se koriste za pomoć policiji u rješavanju tisuća teških slučajeva od kasnih 1980-ih, navodi Nacionalni institut za pravdu. Dokazi na mjestu zločina mogu sadržavati uzorke DNK kostiju, kose ili tjelesnog tkiva koji se mogu usporediti s DNK profilom osumnjičenog kako bi se utvrdilo da li je kriv ili kriv. Lančana reakcija polimeraze (PCR) uobičajena je metoda za kopiranje DNA iz dokaza u tragovima prije sekvenciranja.
- Nizanje novootkrivenih vrsta može vam pomoći identificirati koje su druge vrste najuže povezane i otkriti informacije o evoluciji. Taksonomi koriste DNK "barkodove" za klasifikaciju organizama. Prema Sveučilište Georgia u svibnju 2018. godine procjenjuje se da će 303 vrste sisavaca tek biti otkrivene.
- Genetsko ispitivanje bolesti potražite mutirane varijante gena. Većina su jednonukleotidni polimorfizmi (SNP), što znači da je samo jedan nukleotid u nizu promijenjen iz "normalne" verzije. Čimbenici okoliša i način života utječu na to kako i ako se neki geni izražavaju. Globalne tvrtke čine istraživače širom svijeta zainteresirane za multigene interakcije i sekvenciranje cijelog genoma najmodernijim tehnologijama sekvenciranja nove generacije.
- Genealoški DNK setovi koristiti DNK sekvence u njihovoj bazi podataka da provjere postoje li varijante u genima pojedinca. Za komplet je potreban uzorak sline ili bris obraza koji se poštom šalje u komercijalni laboratorij na analizu. Uz podatke o pradjedovini, neki kompleti mogu identificirati polimorfizme jednostrukih nukleotida (SNP) ili neke druge dobro poznate genetske varijante poput gena BRCA1 i BRCA2 povezane s povišenim rizikom za ženske dojke i rak jajnika.
Etičke implikacije sekvenciranja DNA
Nove tehnologije često dolaze s mogućnošću socijalne koristi, kao i štete; primjeri uključuju neispravno funkcioniranje nuklearnih elektrana i nuklearno oružje za masovno uništavanje. DNA tehnologije dolaze i s rizicima.
Emocionalna zabrinutost zbog alata za sekvenciranje DNA i alata za uređivanje gena poput CRISPR uključuje strahove da će tehnologija bi mogla olakšati kloniranje ljudi ili dovesti do mutiranih transgenih životinja stvorenih od strane lupeža znanstvenik.
Češća etička pitanja vezana uz sekvenciranje DNA imaju veze s informiranim pristankom. Lagan pristup DNK ispitivanju izravno prema potrošaču znači da potrošači možda neće u potpunosti razumjeti kako će se njihovi genetski podaci koristiti, čuvati i dijeliti. Laici možda nisu emocionalno spremni naučiti o svojim oštećenim varijantama gena i zdravstvenim rizicima.
Treće strane poput poslodavaca i osiguravajućih društava mogu potencijalno diskriminirati pojedince koji nose neispravne gene koji mogu dovesti do ozbiljnih medicinskih problema.