Molekularno kloniranje uobičajena je biotehnološka metoda s kojom bi svaki student i istraživač trebao biti upoznat. Molekularno kloniranje uporabom vrste enzima koja se naziva restrikcijski enzim za rezanje ljudske DNA na fragmente koji se zatim mogu umetnuti u plazmidnu DNA bakterijske stanice. Restrikcijski enzimi presijeku dvolančanu DNA na pola. Ovisno o restrikcijskom enzimu, rez može rezultirati ljepljivim ili tupim krajem. Ljepljivi krajevi korisniji su u molekularnom kloniranju jer osiguravaju da se fragment ljudske DNA umetne u plazmid u pravom smjeru. Proces ligacije ili stapanje fragmenata DNA zahtijeva manje DNA kada DNA ima ljepljive krajeve. Na kraju, višestruki ljepljivi restrikcijski enzimi mogu stvoriti isti ljepljivi kraj, iako svaki enzim prepoznaje drugačiju restrikcijsku sekvencu. To povećava vjerojatnost da vaš DNA područje od interesa može biti izrezano ljepljivim krajnjim enzimima.
Restrikcijski enzimi i mjesta za ograničavanje
Restrikcijski enzimi su enzimi koji režu prepoznaju specifične sekvence na dvolančanoj DNA i presijecaju DNA na pola u toj sekvenci. Prepoznati slijed naziva se restrikcijskim mjestom. Restrikcijski enzimi nazivaju se endonukleazama, jer presijecaju dvolančanu DNA, kako DNK inače postoji, na mjestima koja se nalaze između krajeva DNA. Postoji više od 90 različitih restrikcijskih enzima. Svaka prepoznaje posebno mjesto ograničenja. Restrikcijski enzimi cijepe svoja restrikcijska mjesta 5000 puta učinkovitije od ostalih mjesta koja ne prepoznaju.
Prava orijentacija
Restrikcijski enzimi postoje u dvije opće klase. Ili DNA izrezuju na ljepljive krajeve ili tupe krajeve. Ljepljivi kraj ima kratko područje nukleotida, građevnih blokova DNA, koje nije upareno. Ova nesparena regija naziva se prevjesom. Kaže se da je prevjes ljepljiv jer želi i spojit će se s drugim ljepljivim krajem koji ima komplementarni slijed nadvišenja. Ljepljivi krajevi su poput davno izgubljenih blizanaca koji se žele čvrsto zagrliti nakon što se sretnu. S druge strane, tupi krajevi nisu ljepljivi jer su svi nukleotidi već upareni između dva lanca DNA. Prednost ljepljivih krajeva je u tome što se fragment ljudske DNA može uklopiti u bakterijski plazmid samo u jednom smjeru. Suprotno tome, ako i ljudska DNA i bakterijski plazmid imaju tupe krajeve, ljudska DNA može se umetnuti glava-u-rep ili rep-u-glavu u plazmid.
Za povezivanje ljepljivih završetaka potrebno je manje DNA
Iako se DNK s vrhovima štapića lakše pronalaze zbog svoje "ljepljivosti", niti ljepljivi krajevi niti tupi krajevi ne mogu se spojiti u kontinuirani komad DNK. Za stvaranje kontinuiranog dijela DNA koji je potpuno povezan potreban je enzim koji se naziva ligaza. Ligaze povezuju okosnicu nukleotida na ljepljivim ili tupim krajevima, što rezultira kontinuiranim lancem nukleotida. Budući da se ljepljivi krajevi brže međusobno pronalaze zbog međusobne privlačnosti, postupak ligacije zahtijeva manje ljudske DNA i manje plazmidne DNA. Tupi krajevi DNA i plazmidi rjeđe se mogu naći, pa podvezivanje tupih krajeva zahtijeva da se u epruvetu stavi više DNA.
Različiti enzimi mogu dati isti ljepljivi kraj
Mjesta ograničenja smještena su u cijelom genomu organizama, ali nisu ravnomjerno raspoređena. U plazmidima se mogu konstruirati tako da se nalaze tik jedni pored drugih. Znanstvenici koji žele izrezati fragment ljudske DNK iz ljudskog genoma moraju pronaći mjesta ograničavanja koja se nalaze ispred i iza regije fragmenta. Osim što osiguravaju da je fragment DNA umetnut u pravom smjeru, različiti ljepljivi krajnji enzimi mogu stvoriti isti ljepljivi kraj iako prepoznaju različite restrikcijske sekvence. Na primjer, BamHI, BglII i Sau3A imaju različite sekvence prepoznavanja, ali proizvode isti GATC ljepljivi kraj. To povećava vjerojatnost postojanja ljepljivih krajeva s ograničenim mjestima koja okružuju vaš ljudski gen od interesa.