Biokemičari i molekularni biolozi elektroforezom odvajaju makromolekule poput proteina i nukleinskih kiselina. To omogućuje znanstvenicima da izoliraju i analiziraju pojedinačne sekvence proteina ili nukleinske kiseline u složenoj smjesi. Tipičan primjer elektroforeze u laboratoriju je mikrobiolog koji koristi lančanu reakciju polimeraze (PCR) za odvajanje fragmenata DNA stvorenih u mikrobnoj zajednici. Bez obzira na svrhu, elektroforeza uvijek zahtijeva upotrebu puferske otopine.
TL; DR (predugo; Nisam pročitao)
Elektroforeza razdvaja makromolekule poput proteina i nukleinskih kiselina po veličini, naboju i drugim svojstvima. Za elektroforezu koja se odvaja nabojem, znanstvenici koriste pufer za prijenos tog naboja kroz gel. Pufer također održava gel na stabilnom pH, minimizirajući promjene koje bi se mogle dogoditi u proteinu ili nukleinskoj kiselini ako se podvrgnu nestabilnom pH.
Principi elektroforeze
Elektroforeza razdvaja molekule duž gradijenta na temelju njihove veličine, naboja ili drugih svojstava. Taj gradijent može biti električno polje ili, u slučaju elektroforeze s denaturirajućim gradijentnim gelom (DGGE), denaturant poput smjese uree i formamida. Proteini će migrirati prema anodi ako su negativno nabijene, a prema katodi ako su pozitivno nabijene. Budući da veće molekule migriraju sporije od manjih molekula, znanstvenici mogu izmjeriti prijeđeni put i pomoću logaritama odrediti veličinu fragmenata.
Denaturacijska elektroforeza u gradijentnom gelu
S DGGE, DNA se kreće gradijentom sve veće denaturacijske snage sve dok snaga ne bude dovoljna da u potpunosti denaturira ili razvije taj određeni fragment DNA. U ovom trenutku migracija prestaje. Znanstvenici mogu koristiti ovu metodu za odvajanje fragmenata na temelju njihove individualne osjetljivosti na denaturaciju.
Što pufer radi
U slučaju elektroforeze koja se odvaja na osnovi naboja, ioni u puferu prenose naboj potreban za odvajanje. Pufer, pružajući spremnik slabe kiseline i baze, također održava pH unutar uskog raspona. To je važno jer će se struktura i naboj proteina ili nukleinske kiseline promijeniti ako se podvrgnu značajnim promjenama pH, čime se sprječava pravilno razdvajanje.
Tipični odbojnici
Različiti puferi idealni su za održavanje gela za elektroforezu u različitim željenim rasponima pH. Tipični puferi koje znanstvenici koriste u tu svrhu uključuju octenu kiselinu, bornu kiselinu, fosfornu kiselinu i limunsku kiselinu, kao i glicin i taurin. Općenito, vrijednost pKa (konstanta disocijacije kiseline) trebala bi biti blizu potrebnog pH. Nama je poželjnije odbojnike koji pružaju malu veličinu napunjenosti kako ne bi provodili previše struje.
