La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est une technique qui photocopie un fragment d'ADN en plusieurs fragments - de manière exponentielle. La première étape de la PCR consiste à chauffer l'ADN afin qu'il se dénature ou se fonde en brins simples. La structure de l'ADN est comme une échelle de corde dans laquelle les barreaux sont des cordes avec des extrémités magnétiques. Les aimants se connectent pour former les barreaux, appelés paires de bases, et résistent ainsi à l'écartement. Chaque fragment d'ADN fond en brins simples à différentes températures. Comprendre comment la structure de l'ADN est maintenue ensemble par les parties individuelles de l'ADN donnera un aperçu de pourquoi différents fragments d'ADN fondent à différentes températures et pourquoi des températures aussi élevées sont-elles nécessaires dans le premier endroit.
Fusion! Fusion!
La première étape de la PCR consiste à faire fondre l'ADN afin que l'ADN double brin se sépare en ADN simple brin. Pour l'ADN de mammifère, cette première étape implique généralement une chaleur d'environ 95 degrés Celsius (environ 200 Fahrenheit). À cette température, les liaisons hydrogène entre les paires de bases A-T et G-C, ou les barreaux de l'échelle de l'ADN, se séparent, décompressant l'ADN double brin. Cependant, la température n'est pas assez élevée pour casser le squelette phosphate-sucre qui forme les brins simples, ou les pôles de l'échelle. La séparation complète des brins simples les prépare pour la deuxième étape de la PCR, qui consiste à refroidir pour permettre à de courts fragments d'ADN, appelés amorces, de se lier aux brins simples.
Fermetures Magnétiques
L'une des raisons pour lesquelles l'ADN est chauffé à une température élevée de 95 degrés Celsius est que plus le double brin d'ADN est long, plus il veut rester ensemble. La longueur de l'ADN est un facteur qui affecte le point de fusion choisi pour la PCR sur ce morceau d'ADN. Les paires de bases A-T et G-C dans l'ADN double brin se lient les unes aux autres pour maintenir la structure double brin ensemble. Plus les paires de bases consécutives entre deux brins simples se sont liées, plus leurs voisins veulent également se lier et plus l'attraction entre les deux brins devient forte. C'est comme une fermeture éclair faite de petits aimants. Lorsque vous fermez la fermeture éclair, les aimants voudront naturellement se fermer et rester zippés.
Des aimants plus puissants collent plus étroitement
Un autre facteur qui affecte la température de fusion à choisir pour votre fragment d'ADN d'intérêt est la quantité de paires de bases G-C présentes dans ce fragment. Chaque paire de base est comme deux mini-aimants qui s'attirent. Une paire composée de G et C est beaucoup plus fortement attirée qu'une paire A et T. Ainsi, un morceau d'ADN qui a plus de paires G-C qu'un autre fragment nécessitera une température plus élevée avant de fondre en brins simples. L'ADN absorbe naturellement la lumière ultraviolette - à la longueur d'onde de 260 nanomètres, pour être exact - et l'ADN simple brin absorbe plus de lumière que l'ADN double brin. Ainsi, mesurer la quantité de lumière absorbée est un moyen de mesurer à quel point votre ADN double brin a fondu en brins simples. L'effet "fermeture éclair magnétique" des paires de bases G-C et A-T est ce qui provoque un graphique de l'absorbance lumineuse de ADN double brin tracé en fonction d'une augmentation de la température pour être sigmoïde, en forme de S et non de ligne droite. La courbe du S représente la résistance au travail d'équipe que les paires de bases exercent contre la chaleur car elles ne veulent pas se séparer.
Le point à mi-chemin
La température à laquelle une longueur d'ADN fond en brins simples s'appelle sa température de fusion, qui est désignée par l'abréviation « Tm ». Cela indique la température à laquelle la moitié de l'ADN dans une solution a fondu en simple brin et l'autre moitié est toujours en double brin forme. La température de fusion est différente pour chaque fragment d'ADN. L'ADN de mammifère a une teneur en G-C de 40 %, ce qui signifie que les 60 % restants des paires de bases sont des As et des T. Sa teneur en G-C de 40% fait fondre l'ADN des mammifères à 87 degrés Celsius (environ 189 Fahrenheit). C'est pourquoi la première étape de la PCR sur l'ADN de mammifère consiste à le chauffer à 94 degrés Celsius (201 Fahrenheit). Seulement sept degrés de plus que la température de fusion et tous les doubles brins fondront complètement en brins simples.