Les membranes cellulaires sont constituées de phospholipides et de protéines attachées ou incorporées. Les protéines membranaires jouent un rôle vital dans le métabolisme et la vie de la cellule. Vous ne pouvez pas utiliser la microscopie ordinaire pour visualiser ou caractériser les protéines d'adhésion, les protéines de transport et les canaux protéiques dans la membrane cellulaire. En utilisant la microscopie électronique et une technique appelée "freeze fracture", qui sépare les membranes cellulaires congelées, permet de visualiser la structure membranaire et l'organisation des protéines dans la mer de phospholipides. La combinaison d'autres méthodes avec la fracturation par congélation nous aide non seulement à comprendre la structure des différentes membranes cellulaires et protéines membranaires, mais permet la visualisation et l'analyse détaillée de la fonction de protéines, bactéries et virus.
Étapes de base de la fracture par congélation
À l'aide d'azote liquide, des échantillons de tissus biologiques ou des cellules sont rapidement congelés pour immobiliser les constituants cellulaires. Les membranes cellulaires sont composées de deux couches de phospholipides, appelées bicouche, où les queues lipidiques hydrophobes, ou qui détestent l'eau, pointent vers l'intérieur de la membrane et les extrémités hydrophiles, ou hydrophiles, de la molécule lipidique pointent vers l'extérieur et vers l'intérieur de la cellule. L'échantillon congelé est fissuré ou fracturé avec un microtome, qui est un instrument semblable à un couteau pour couper de fines tranches de tissu. Cela provoque la séparation précise de la membrane cellulaire entre les deux couches, car l'attraction entre les queues lipidiques hydrophobes représente le point le plus faible. Après la fracturation, l'échantillon subit une procédure sous vide, appelée "freeze etching". La surface de la fracture l'échantillon est ombré avec de la vapeur de carbone et de platine pour faire une réplique stable, qui suit les contours de la fracture avion. L'acide est utilisé pour digérer la matière organique adhérant à la réplique, laissant une fine coquille de platine de la surface de la membrane fracturée. Cette coquille est ensuite analysée par microscopie électronique.
Geler la gravure
La gravure par congélation est le séchage sous vide d'un échantillon biologique non fixé, congelé et fracturé par congélation. La procédure de séchage sous vide est similaire à la lyophilisation des fruits et légumes qui sont emballés et vendus dans les épiceries. Sans gravure par congélation, de nombreux détails de la structure cellulaire sont masqués par les cristaux de glace. L'étape de gravure profonde ou cryogravure améliore et étend la méthode originale de fracture par congélation, permettant l'observation des membranes cellulaires au cours de diverses activités. Il permet l'analyse non seulement de la structure membranaire, mais aussi des composants intracellulaires et fournit des informations structurelles détaillées sur les bactéries, les virus et les grandes protéines cellulaires complexes.
Microscopie électronique
La microscopie électronique peut révéler et agrandir plus d'un million de fois les plus petits organismes ou structures, tels que les bactéries, les virus, les composants intracellulaires et même les protéines. La visualisation est créée en bombardant un échantillon ultra-mince avec un faisceau d'électrons. Les deux méthodes de microscopie électronique sont la microscopie électronique à balayage, ou SEM, et la microscopie électronique à transmission, ou MET. Les échantillons de fracture de congélation sont systématiquement analysés par MET. Le TEM a une meilleure résolution que le SEM et offre des informations structurelles jusqu'à 3 nanomètres de répliques.
Révéler la structure de la membrane cellulaire
Le développement et l'utilisation de la microscopie électronique à fracture par congélation ont montré que les membranes plasmiques cellulaires sont constituées de bicouches lipidiques et ont clarifié la façon dont les protéines sont organisées au sein des membranes cellulaires. La fracture de congélation donne un aspect unique à l'intérieur des membranes cellulaires, car elle divise et sépare les phospholipides membranaires en deux feuilles ou faces opposées et complémentaires. Plus de 50 ans après l'introduction de la première machine de cryofracturation, la fabrication d'une réplique en platine reste le seul moyen d'obtenir des informations structurelles sur la membrane cellulaire. La technique montre si des protéines spécifiques flottent ou sont ancrées dans la membrane cellulaire, et si et comment certaines protéines s'agrègent. Une méthode plus récente - utilisant des anticorps qui ciblent des protéines spécifiques - est combinée à une fracture par congélation pour identifier les protéines et leur fonction dans la membrane cellulaire.