ADN
Acide désoxyribonucléique et protéines. L'ADN est organisé en unités appelées gènes, dont chacune code pour une séquence d'ARN ou de protéine particulière. Les gènes sont étudiés pour en savoir plus sur la structure et la fonction biologiques, l'évolution, la maladie et de nombreux autres aspects des systèmes vivants. Pour étudier les gènes en détail, l'ADN doit être isolé et purifié à partir des cellules d'intérêt.
Extraction d'ADN
Bien que l'ADN d'une seule cellule puisse être extrait et étudié, il ne suffit pas de le voir à l'œil nu. Pour obtenir une quantité suffisante pour le spooling, plus vous devez travailler avec des cellules, mieux c'est (plusieurs millions).
Les protocoles exacts varient considérablement pour tenir compte des caractéristiques uniques d'échantillons spécifiques, mais les étapes générales sont l'homogénéisation, la lyse, la digestion, la séparation et la collecte. La procédure est mieux réalisée dans un petit tube (selon la taille de l'échantillon) en verre ou en plastique.
Un échantillon est généralement mélangé ou broyé pour bien séparer les cellules les unes des autres. Cela rend les ingrédients cellulaires plus accessibles aux réactifs qui suivent. Un détergent ou des enzymes sont ensuite ajoutés à l'homogénat pour lyser les membranes cellulaires (et les membranes nucléaires si les cellules sont eucaryotes) pour libérer l'ADN. À ce stade, l'ADN est entouré de protéines, de lipides, de glucides et de tout ce qui était contenu dans les cellules.
Une digestion enzymatique supplémentaire peut être nécessaire pour décomposer les protéines afin qu'elles ne se lient pas à l'ADN et n'interfèrent pas avec sa collecte. L'ADN est séparé du reste du contenu cellulaire en ajoutant de l'alcool éthylique ou isopropylique froid et pur. L'ADN n'est pas soluble dans ces alcools, il se condensera donc pour essayer de minimiser son contact avec l'alcool. L'ADN condensé est ensuite collecté, généralement par centrifugation ou enroulement.
Bobinage d'ADN
La collecte d'ADN par spooling est efficace lorsqu'une grande quantité d'ADN est obtenue à partir d'une procédure d'extraction. C'est aussi une excellente méthode de démonstration puisqu'un impressionnant enchevêtrement d'ADN pur est clairement visible.
Pour bobiner l'ADN, l'étape de séparation doit être effectuée avec soin. S'il ne faisait pas partie du mélange de réactifs de lyse précédemment ajouté, une solution saline concentrée (chlorure de sodium) doit être ajoutée à la solution avant l'étape d'ajout d'alcool. L'alcool froid est versé lentement sur le côté du tube à essai pour former une couche au-dessus de la solution aqueuse, en évitant le mélange. Si cela est fait correctement, l'alcool formera sa propre couche au-dessus de la couche salée. Vient ensuite le bobinage.
Pour collecter l'ADN de la couche salée, placez soigneusement une tige d'agitation en verre à travers la couche d'alcool jusqu'à ce qu'elle touche le fond du tube. Faites tourner lentement la tige entre les doigts, tout en surveillant l'interface entre les deux couches. Si suffisamment d'ADN est présent, il s'agglutinera à l'interface entre les couches pour former une masse laiteuse translucide. Faites tourner la tige pour enrouler l'ADN autour d'elle (c'est-à-dire la partie de bobinage) et retirez-la du tube. L'ADN peut être transféré dans un autre tube d'alcool pur pour le stockage ou une analyse plus approfondie.