Le clonage moléculaire est une méthode de biotechnologie courante que chaque étudiant et chercheur devrait connaître. Clonage moléculaire utilisant un type d'enzyme appelé enzyme de restriction pour couper l'ADN humain en fragments qui peuvent ensuite être insérés dans l'ADN plasmidique d'une cellule bactérienne. Les enzymes de restriction coupent l'ADN double brin en deux. Selon l'enzyme de restriction, la coupure peut donner soit une extrémité collante, soit une extrémité émoussée. Les extrémités collantes sont plus utiles dans le clonage moléculaire car elles garantissent que le fragment d'ADN humain est inséré dans le plasmide dans la bonne direction. Le processus de ligature, ou fusion de fragments d'ADN, nécessite moins d'ADN lorsque l'ADN a des extrémités collantes. Enfin, plusieurs enzymes de restriction d'extrémité collante peuvent produire la même extrémité collante, même si chaque enzyme reconnaît une séquence de restriction différente. Cela augmente la probabilité que votre région d'ADN d'intérêt puisse être coupée par des enzymes d'extrémité collante.
Enzymes de restriction et sites de restriction
Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent, reconnaissent des séquences spécifiques sur l'ADN double brin et coupent l'ADN en deux au niveau de cette séquence. La séquence reconnue est appelée site de restriction. Les enzymes de restriction sont appelées endonucléases parce qu'elles coupent l'ADN double brin, qui est la façon dont l'ADN existe normalement, à des emplacements qui se trouvent entre les extrémités de l'ADN. Il existe plus de 90 enzymes de restriction différentes. Chacun reconnaît un site de restriction distinct. Les enzymes de restriction clivent leurs sites de restriction respectifs 5 000 fois plus efficacement que d'autres sites qu'elles ne reconnaissent pas.
La bonne orientation
Les enzymes de restriction se répartissent en deux classes générales. Ils coupent l'ADN en extrémités collantes ou en extrémités émoussées. Une extrémité collante a une courte région de nucléotides, les éléments constitutifs de l'ADN, qui n'est pas apparié. Cette région non appariée est appelée un surplomb. Le porte-à-faux est dit collant parce qu'il veut et s'appariera avec une autre extrémité collante qui a une séquence de porte-à-faux complémentaire. Les extrémités collantes sont comme des jumeaux perdus de vue qui cherchent à se serrer dans les bras une fois qu'ils se sont rencontrés. En revanche, les extrémités franches ne sont pas collantes car tous les nucléotides sont déjà appariés entre les deux brins d'ADN. L'avantage des extrémités collantes est qu'un fragment d'ADN humain ne peut s'insérer dans un plasmide bactérien que dans une seule direction. En revanche, si à la fois l'ADN humain et le plasmide bactérien ont des extrémités franches, l'ADN humain peut être inséré tête-bêche ou queue-à-tête dans le plasmide.
La ligature des extrémités collantes nécessite moins d'ADN
Bien que l'ADN avec des extrémités en bâtonnets ait plus de facilité à se trouver en raison de leur "adhérence", ni les extrémités collantes ni les extrémités émoussées ne peuvent fusionner en un morceau continu d'ADN. La formation d'un morceau continu d'ADN qui est complètement lié nécessite une enzyme appelée ligase. Les ligas relient les épines dorsales des nucléotides aux extrémités collantes ou émoussées, résultant en une chaîne continue de nucléotides. Parce que les extrémités collantes se trouvent plus rapidement en raison de leur attraction l'une pour l'autre, le processus de ligature nécessite moins d'ADN humain et moins d'ADN plasmidique. Les extrémités franches de l'ADN et des plasmides sont moins susceptibles de se trouver, et donc la ligature des extrémités franches nécessite que plus d'ADN soit mis dans le tube à essai.
Différentes enzymes peuvent donner la même extrémité collante
Les sites de restriction sont situés dans tout le génome des organismes, mais ne sont pas régulièrement espacés. Dans les plasmides, ils peuvent être conçus pour être situés juste à côté les uns des autres. Les scientifiques qui veulent découper un fragment d'ADN humain du génome humain doivent trouver des sites de restriction qui se trouvent à l'avant et à l'arrière de la région du fragment. En plus de garantir qu'un fragment d'ADN est inséré dans la bonne direction, différentes enzymes d'extrémité collante peuvent créer la même extrémité collante même si elles reconnaissent différentes séquences de restriction. Par exemple, BamHI, BglII et Sau3A ont des séquences de reconnaissance différentes mais produisent la même extrémité collante GATC. Cela augmente la probabilité qu'il y ait des sites de restriction d'extrémité collante qui flanquent votre gène humain d'intérêt.