Selon le site Web BioWeb de l'Université du Wisconsin, une amorce PCR est un court oligonucléotide synthétique (généralement entre 18 à 25 bases de long) utilisé pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN dans une technique de biologie moléculaire connue sous le nom de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une amorce directe et une amorce inverse sont nécessaires, conçues pour être des compléments inverses du brin d'ADN, pour flanquer et se lier à la région d'ADN souhaitée. Lorsque les scientifiques souhaitent effectuer des recherches sur un gène ou une région spécifique de l'ADN, ils doivent d'abord effectuer une PCR pour acquérir suffisamment de la région cible avec laquelle travailler. La conception de séquences d'amorces pour la région d'intérêt peut être nécessaire si elles ne sont pas déjà disponibles par le biais de recherches publiées précédemment ou par des moyens commerciaux.
Obtenez la séquence nucléotidique du gène ou de la région d'ADN d'intérêt et décidez de la durée d'un fragment que vous souhaitez amplifier. L'amorce directe et inverse est conçue pour se lier au début et à la fin du fragment souhaité. En règle générale, les méthodes PCR conventionnelles utilisent des amorces qui flanquent une région d'une longueur comprise entre 100 et 1 000 paires de bases, tandis que les méthodes PCR en temps réel utilisent des fragments longs d'environ 50 à 200 paires de bases.
Décidez où dans la séquence vous voulez que les amorces se trouvent. Par exemple, vous pouvez souhaiter l'emplacement près de l'extrémité 5' ou 3' de la séquence ou au milieu. Si vous le souhaitez, désignez l'emplacement des amorces pour couvrir un intron.
Concevez les amorces d'une longueur de 18 à 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph. D., de Brinkmann Instruments Inc., suggère que cette longueur est suffisamment longue pour être extrêmement spécifique à la région d'ADN souhaitée, mais suffisamment courte pour se lier (s'hybrider) facilement. La température de fusion de l'amorce (Tm) doit être comprise entre 55 et 80 degrés Celsius, suffisamment basse pour permettre une fusion complète à ou au-dessus de 90 degrés Celsius, mais suffisamment élevée pour permettre le recuit. La teneur en GC (pourcentage de Gs et Cs dans la séquence) doit être comprise entre 40 et 60 pour cent. L'extrémité 3' de la séquence d'amorce doit se terminer par un C ou un G (appelé pince GC) pour favoriser la liaison, car les G et C les nucléotides ont des liaisons plus fortes, cependant, évitez d'avoir trois G ou C ou plus dans les cinq dernières bases de la séquence.
Évitez d'avoir des séries de quatre ou plus d'une base (comme ACCCC...) ou de quatre répétitions di-nucléotidiques ou plus (comme AATATAT...) car elles peuvent provoquer une erreur d'amorçage. Concevoir des amorces sans homologie intra-amorce (plus de trois bases qui se complètent dans une amorce elle-même) ou une homologie inter-amorces (où les amorces directe et inverse ont une complémentation séquences). Cela peut provoquer des auto-dimères ou des amorces-dimères, où les amorces se lient à elles-mêmes au lieu de se lier à la séquence d'ADN souhaitée.
Utilisez des ressources en ligne et des sites Web qui aident à la conception des amorces ou aident à vérifier l'auto-complémentarité des séquences d'amorces ou la possibilité de créer des structures secondaires comme des épingles à cheveux. Certains sites Web de conception d'amorces incluent Primer3 du Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast du National Center for Biotechnology Information et OligoAnalyzer d'Integrated DNA Technologies.