L'électrophorèse sur gel est une technique qui permet d'analyser l'ADN au niveau de ses molécules constitutives. Dans cette méthode de visualisation d'ADN, les échantillons sont placés sur un milieu de gel d'agarose et un champ électrique est appliqué au gel. Cela provoque la migration de fragments d'ADN à travers le gel à des vitesses différentes en fonction de leurs propriétés électrochimiques.
Le bromure d'éthidium
Pour cette technique de visualisation, le bromure d'éthidium est mélangé avec de la poudre d'agarose, du tampon EDTA et de l'eau pour former la matrice de gel avant l'électrophorèse. En conséquence, les molécules de bromure d'éthidium se dispersent uniformément dans toute la matrice. Une fois que les puits du gel ont été remplis de leurs échantillons d'ADN respectifs et de leurs colorants de suivi, une tension est appliquée pour attirer lentement les gros composés polaires à travers la matrice.
Au cours de ce mouvement, les bases des molécules d'ADN se fixent temporairement sur les particules grâce à la charge de bromure d'éthidium, les entraînant. Au moment où l'électrophorèse sur gel est terminée, chaque molécule d'ADN a capté une quantité significative de bromure d'éthidium.
En présence de lumière ultraviolette, le bromure d'éthidium présente une fluorescence. Les techniciens projettent une lumière UV spécialement calibrée sur le gel tandis qu'une machine capture l'image des fragments incandescents.
Bleu de méthylène
Si un transilluminateur UV n'est pas disponible ou pratique, les techniciens peuvent rendre l'ADN visible dans des conditions normales en trempant le gel d'agarose fini, avec l'ADN électrophorèse à l'intérieur, dans une solution de bleu de méthylène pendant la nuit.
Sel de chlorure avec un anion significativement hydrophobe, les molécules de bleu de méthylène pénètrent dans toute la matrice du gel. Cependant, la liaison hydrogène dans l'ADN provoque l'accumulation des molécules de coloration. Cette densité de coloration d'ADN accrue donne une nuance de bleu plus profonde, visible à l'œil nu.
Suivi des colorants
Au-delà de la taille relative des bandes d'ADN, les techniciens peuvent mesurer la taille absolue (en paires de bases) de chaque fragment à l'aide de produits chimiques appelés colorants de suivi. Visibles sans ajout de bleu de méthylène ou de bromure d'éthidium, les colorants de suivi tels que le bleu de bromophénol et le xylène cyanol se déplacent à travers le des matrices de gel d'aragose lors de l'électrophorèse à la même vitesse que des fragments d'ADN constitués de 300 nucléotides et de 4 000 nucléotides, respectivement. En électrophorèse, des fragments d'ADN plus massifs traversent la matrice de gel à une vitesse plus lente que les fragments plus petits. Par conséquent, bien que les colorants de suivi n'influencent pas directement la visibilité des fragments d'ADN, la comparaison de la position d'un fragment d'ADN dans le gel à la position de ces colorants permettent aux techniciens de "voir" le nombre approximatif de nucléotides du fragment d'ADN contient.