L'électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) est une méthode biochimique d'identification des protéines en solution. Comme illustré par Mathews et al dans « Biochimie », les échantillons de protéines sont d'abord chargés dans des « puits » ou des trous à une extrémité du bloc de gel de polyacrylamide. Un champ électrique est ensuite appliqué au gel. Le SDS, ajouté aux échantillons chargés, annule la charge naturelle des protéines. Pour cette raison, le poids moléculaire des protéines détermine à lui seul la vitesse de migration des protéines lorsqu'elles se déplacent à travers le gel vers le pôle chargé positivement, note Bitesize Bio. Plusieurs protéines dans le même échantillon se sépareront donc les unes des autres et migreront vers des positions différentes.
Orientez la photographie gel. "Top" est l'emplacement des puits où les échantillons ont été initialement ajoutés. "En bas" est l'endroit où les échantillons ont migré vers et contient le plus souvent le front de colorant qui indique le front de migration des échantillons. La gauche ou la droite doit contenir un "marqueur", utilisé comme guide de poids moléculaire prévisible.
Étiquetez les échantillons pour chaque voie. En haut, les échantillons ajoutés aux puits auront migré verticalement dans des "voies". Par conséquent, toutes les barres visibles dans une colonne verticale provenaient de l'échantillon chargé directement au-dessus. Utilisez la règle et le stylo pour mettre des bordures sur les voies s'il est difficile de visualiser les colonnes.
Étiquetez les tailles moléculaires des bandes dans la voie du marqueur. Les marqueurs disponibles dans le commerce sont accompagnés d'une image du motif de bande à attendre ainsi que des poids moléculaires de chaque bande. Les bandes sont les "barres" horizontales sombres, qui sont en fait des protéines colorées intégrées dans le gel.
Tracez des lignes horizontales claires s'étendant de chaque bande de marqueur au bord opposé du gel. Veillez à faire ces lignes parallèles aux puits et au front de teinture. Ces lignes indiquent où les protéines du poids moléculaire indiqué par chacune des bandes marqueurs seraient situées dans chaque piste. Par exemple, une bande dans la voie 4 qui se trouve juste en dessous de la ligne prolongée à partir du 25 kilodalton La bande de marqueur suggérerait que la bande de la voie 4 est presque mais pas tout à fait 25 kilodaltons en moléculaire poids.
Étiquetez chaque bande dans chaque voie avec son poids moléculaire estimé. Utilisez les marqueurs comme guide et estimez les valeurs entre les tailles de marqueur.
Au-dessous de la photographie de gel, faites une liste de "protéines" pour chaque voie. Commencez par indiquer ce que l'on sait de chaque échantillon, comme son origine ou ses conditions. Ensuite, énumérez le poids moléculaire estimé de chaque bande dans la piste. Les pistes avec une bande indiquent que l'échantillon ne contient qu'une seule protéine. Les pistes avec plusieurs bandes indiquent la présence de plusieurs protéines. Les bandes qui suivent le front de migration sont plus petites que ce que suggère le marqueur le plus proche et ne peuvent probablement pas être prédites, sauf si elles sont "plus petites que" le marqueur indique.
Dans la liste des protéines, notez les bizarreries. Un aspect « barbouillé » peut indiquer que trop de protéines sont présentes ou que la viscosité de l'échantillon a affecté sa migration Si les bandes semblent dépasser le bord de la voie ou sont assez grandes par rapport à d'autres bandes, alors la concentration de cette protéine est probablement trop élevée et devrait être diluée à l'avenir électrophorèse. Une teinte grisâtre sur toute la piste, plus foncée que la couleur du gel de fond, indique des fragments de protéines indiscernables.
Déterminer l'identité des protéines dans chaque piste. Bien que cela soit fait en utilisant uniquement le poids moléculaire, la source de chaque voie indiquera probablement également des indices. Considérez que dans certaines conditions, les protéines peuvent maintenir une association dimère ou trimère sur un gel. Par conséquent, une protéine peut apparaître sur un gel sous forme de trois bandes distinctes. Même si les protéines ne peuvent pas être identifiées, l'obscurité relative des bandes peut impliquer les concentrations des protéines en solution. Toutes les protéines curieuses et inconnues peuvent être isolées directement du gel d'origine et envoyées pour identification.
Choses dont vous aurez besoin
- Photographie du gel SDS-PAGE, coloré
- Clé pour marqueur de poids moléculaire utilisé
- Règle
- Stylo