La chromatographie liquide à haute performance est une technique d'analyse en laboratoire d'un mélange. C'est un type de chromatographie efficace qui utilise une pression élevée, plutôt que simplement la gravité, pour propulser un échantillon d'un mélange à travers une colonne. Un échantillon est injecté, puis une pompe à haute pression aide à déplacer l'échantillon le long d'une colonne garnie, où il est séparé en composants individuels. Cette séparation est ensuite analysée par un détecteur pour donner des résultats.
Site d'injection
Afin d'être injecté dans une HPLC, un échantillon doit d'abord être dissous dans un solvant liquide polaire, de préférence un avec des spectres HPLC connus afin que ses données puissent être distinguées de celles de l'échantillon. La solution liquide contenant l'échantillon est placée dans l'instrument et est envoyée dans la colonne. L'emplacement réel du site d'injection dépend de la marque des instruments. Dans la plupart des cas, le processus d'injection est automatisé, mais dans certains cas, un travailleur de laboratoire doit injecter l'échantillon à l'aide d'une petite aiguille de seringue.
Composant de la pompe
Le composant pompe de l'unité HPLC est nécessaire car il fournit la pression qui propulse l'échantillon à travers la colonne. La force de la pompe varie, mais une pompe puissante peut produire une pression allant jusqu'à 6 000 psi, ou livres par pouce carré, qui est appliquée après l'injection de l'échantillon. Cela permet à l'échantillon de traverser la colonne plus rapidement et plus efficacement que s'il s'égouttait en utilisant uniquement la force de gravité.
Description de la colonne
La vitesse accrue d'un échantillon passé à travers la colonne par une pompe permet d'utiliser un type de colonne différent de ceux utilisés en chromatographie liquide simple. Le matériau de garnissage de la colonne peut avoir une taille de particule beaucoup plus petite, ce qui augmente la surface spécifique et facilite donc les interactions de l'échantillon avec la colonne. La plupart des colonnes HPLC fonctionnent par polarité. L'échantillon est dissous dans un solvant polaire et la colonne est constituée en grande partie d'hydrocarbures non polaires. Les parties polaires de la molécule échantillon traversent la colonne très rapidement car elles interagissent principalement avec le solvant, tandis que les composants non polaires de l'échantillon persistent dans la colonne, formant de faibles interactions avec la colonne Composants. Par conséquent, les composants de l'échantillon sortent de la colonne dans l'ordre du plus polaire au plus non polaire.
Fonction de détecteur
Les détecteurs varient également en fonction du type d'instrument HPLC utilisé. Cependant, la plupart fonctionnent de la même manière de base. Une source de lumière ultraviolette éclaire les composants de l'échantillon séparés lorsqu'ils sortent de la colonne. La plupart des composés organiques absorbent une certaine quantité de lumière, de sorte qu'en passant devant le faisceau lumineux appliqué, un détecteur peut capter la quantité de lumière absorbée. Le détecteur enregistre également le temps de rétention des composants en fonction de l'ordre dans lequel ils sortent de la colonne. Cette sortie peut ensuite être analysée en fonction de la surface du pic pour déterminer la nature exacte des composants de l'échantillon.