Molekyylibiologiassa hyvä puskurivalinta ja valmistelu erilaisiin DNA-eristysvaiheisiin voi olla ero proteiiniekspressioon siirtymisen tai toisen maxi-prep -pakkauksen avaamisen välillä aloittaakseen yli. Puskurireseptit ovat ratkaisevasta tärkeydestään huolimatta usein juuri ne - reseptit, jotka on kirjoitettu selittämättä tai perustelematta eri komponentteja. Yksi tällainen puskuri on glukoosi-tris-EDTA- tai GTE-puskuri.
Mihin GTE: tä käytetään?
GTE: tä käytetään suspensoimaan bakteerisolupelletit ennen solujen hajottamista (murtamista) ja plasmidi-DNA: n keräämistä sisälle. Lysotsyymiä, joka pehmentää solukalvoja, lisätään usein yhdessä GTE-puskurin kanssa. Hyvien DNA-saantojen saaminen on avain kokonaisten solujen homogeenisen suspension saavuttamiseen tämän vaiheen aikana, jotta myöhemmin lisätty hajotusliuos pääsee kaikkiin soluihin. GTE on suunniteltu tekemään tämä samalla, kun se tarjoaa myös vakaan ympäristön DNA: lle.
Glukoosi osmolaarisuudelle
50 mM (millimolaarinen) glukoosisokeri lisätään GTE-puskuriin osmolaarisuuden ylläpitämiseksi, kun soluainepitoisuus solujen ulkopuolella on lähellä solujen sisäistä pitoisuutta. Tämä estää ennenaikaisen solujen hajoamisen, mikä voi aiheuttaa pienempiä DNA-saantoja aggregaation ja hajoamisen vuoksi. Puskurin muut komponentit myötävaikuttavat myös liuoksen osmolaarisuuteen, mutta glukoosi, ei-elektrolyytti on hyvä valinta, koska se ei häiritse liuoksen puskuria ominaisuudet.
Tris pH-stabiilisuudelle
Tris on lyhyt nimi tris (hydroksimetyyli) aminometaanille, joka on hyvin yleinen pH-puskuri. GTE-puskurin tapauksessa happosuola (Tris-HCI) lisätään puskuriin konsentraationa 25 mM. Tämä pitää liuoksen pH: n lähes fysiologisessa 8,0: ssa, ihanteellisen pH: n estämään plasmidi-DNA: n happohydrolyysi (hajoaminen) ja muiden solukomponenttien ei-toivotut sivureaktiot.
EDTA estää DNA: n hajoamisen
EDTA tai etyleenidiamiinitetraetikkahappo sieppaa tai "kelatoi" metalli-ionit liuoksesta estäen niitä osallistumasta ei-toivottuihin sivureaktioihin. GTE-puskurissa EDTA lisätään 10 mM. Sen ensisijainen tarkoitus on puskurissa pyöristää vapaata sinkkiä, magnesiumia ja kalsiumia estäen siten DNA: n hajoamisen tietyillä reiteillä, jotka vaativat näitä metalleja.
Joitakin tärkeitä vinkkejä
Pidä GTE-puskurisi kylmänä ja tee se pieninä määrinä estääksesi tahattomien bakteerien kasvun siinä. Sokeri ja kontrolloitu pH tekevät loistavasta kasvualustasta. Käytä aina puhdistettua vettä. Vesijohtovedessä voi olla ylimäärä metalli-ioneja putkista, mikä voi ylittää EDTA: n kyvyn siepata. Jos epäilet, että näytteessäsi on häiritsevää RNA: ta, lisää RNaasi A: ta 100 mikrogrammaa millilitrassa GTE-puskuriin ongelman poistamiseksi.