Mis on polümeraasi ahelreaktsiooni esimene samm?

Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR on tehnika, mis kopeerib ühe DNA fragmendi paljudeks fragmentideks - eksponentsiaalselt paljudeks. Esimene samm PCR-is on DNA kuumutamine nii, et see denatureeriks või sulaks üksikuteks ahelateks. DNA struktuur on nagu köisredel, milles astmed on magnetiliste otstega köied. Magnetid ühenduvad astmete moodustamiseks, mida nimetatakse aluspaarideks, ja seeläbi takistatakse nende lahti tõmbamist. Iga DNA fragment sulab erinevatel temperatuuridel üksikuteks ahelateks. Mõistmine, kuidas DNA üksikud osad hoiavad DNA struktuuri koos, annab ülevaate, miks erinevad DNA fragmendid sulavad erinevatel temperatuuridel ja miks esimeses on vaja nii kõrgeid temperatuure koht.

PCR-i esimene etapp on DNA sulatamine nii, et kaheahelaline DNA eralduks üheahelaliseks DNA-ks. Imetajate DNA puhul hõlmab see esimene etapp tavaliselt umbes 95 kraadi Celsiuse (umbes 200 Fahrenheiti) kuumust. Sellel temperatuuril lagunevad vesiniksidemed A-T ja G-C aluspaaride vahel või DNA redelipulgad, purunedes lahti kaheahelalise DNA. Temperatuur ei ole siiski piisavalt kuum, et purustada fosfaadi-suhkru selgroog, mis moodustab üksikud kiud või redeli poolused. Üksikute ahelate täielik eraldamine valmistab neid ette PCR-i teiseks etapiks, mis jahutab, võimaldades lühikestel DNA fragmentidel, mida nimetatakse praimeriteks, üksikute ahelate seondumiseks.

Üks põhjus, miks DNA kuumutatakse kõrge temperatuurini 95 kraadi Celsiuse järgi, on see, et mida pikem on DNA kaheahelaline, seda rohkem soovitakse koos püsida. DNA pikkus on üks tegur, mis mõjutab selle DNA tüki PCR jaoks valitud sulamistemperatuuri. A-T ja G-C aluspaarid on kaheahelalises DNA-sidemes üksteisega, et hoida kaheahelalist struktuuri koos. Mida rohkem on kahe üksikahelaga järjestikuseid aluspaare omavahel ühendatud, seda enam tahavad ka nende naabrid siduda ja seda tugevamaks muutub kahe ahela vaheline külgetõmme. See on nagu väikestest magnetitest valmistatud tõmblukk. Tõmblukku sulgedes soovivad magnetid loomulikult lukku tõmmata ja lukuga püsida.

Teine tegur, mis mõjutab huvipakkuva DNA fragmendi jaoks valitud sulamistemperatuuri, on selles fragmendis olevate G-C aluspaaride hulk. Iga aluspaar on nagu kaks minimagnetit, mis tõmbavad ligi. G-st ja C-st valmistatud paar on palju tugevamalt meelitatud kui A- ja T-paar. Seega vajab DNA tükk, millel on rohkem G-C paare kui teisel fragmendil, enne üksikuteks ahelateks sulamist kõrgemat temperatuuri. DNA neelab loomulikult ultraviolettvalgust - täpsemalt lainepikkusel 260 nanomeetrit - ja üheahelaline DNA neelab rohkem valgust kui kaheahelaline DNA. Nii et neeldunud valguse hulga mõõtmine on viis mõõta, kui palju teie kaheahelaline DNA on sulanud üksikuteks kiududeks. G-C ja A-T aluspaaride "magnetilise tõmblukuga" efekt põhjustab graafiku valguse neeldumise kaheahelaline DNA, mis on temperatuuri tõusu vastu kujutatud sigmoidse kujuga, S-kujuline ja mitte a sirgjoon. S kõver tähistab meeskonnatöö takistust, mida aluspaarid kuumuse vastu avaldavad, kuna nad ei taha eralduda.

Temperatuuri, mille juures DNA pikkus sulab üksikuteks ahelateks, nimetatakse selle sulamistemperatuuriks, mida tähistatakse lühendiga “Tm”. See näitab temperatuuri, mille juures pool lahuse DNA-st on sulanud üksikuteks ahelateks ja teine ​​pool on endiselt kaheahelaline vormis. Sulamistemperatuur on iga DNA fragmendi jaoks erinev. Imetajate DNA G-C sisaldus on 40%, mis tähendab, et ülejäänud 60% aluspaaridest on As ja Ts. Selle 40% G-C sisaldus põhjustab imetaja DNA sulamist 87 kraadi Celsiuse järgi (umbes 189 Fahrenheiti). Sellepärast on imetaja DNA-l esimene PCR-i samm selle kuumutamisel temperatuurini 94 kraadi (201 Fahrenheiti). Vaid seitse kraadi sulamistemperatuurist kuumem ja kõik kahekordsed kiud sulavad täielikult üksikuteks kiududeks.