Molekulaarbioloogias võib puhvri valimine ja ettevalmistamine erinevateks DNA eraldamise etappideks olla hea erinevus valguekspressioonile liikumise või teise maxi-prep komplekti avamise vahel alustamiseks üle. Hoolimata nende üliolulisest tähtsusest, on puhveretseptid sageli just sellised - retseptid, mis on kirjutatud ilma erinevate komponentide selgituse või põhjenduseta. Üks selline puhver on glükoos-tris-EDTA või GTE puhver.
Milleks GTE-d kasutatakse?
GTE-d kasutatakse bakterirakkude pelletite resuspendeerimiseks enne rakkude lüüsimist (lahti murdmist) ja seestpoolt plasmiidi DNA kogumist. Sageli lisatakse koos GTE puhvriga rakumembraane pehmendavat lüsosüümi. Tervete rakkude homogeense suspensiooni saavutamine selle etapi jooksul, et järgnevalt lisatud lüüsilahus jõuaks kõikidesse rakkudesse, on hea DNA saagise saavutamise võti. GTE on loodud selleks, pakkudes samas ka DNA-le stabiilset keskkonda.
Glükoos osmolaarsuse jaoks
Osmolaarsuse säilitamiseks lisatakse GTE puhvrisse 50 mM (millimolaarne) glükoosisuhkur, kus lahustunud aine kontsentratsioon rakkudest väljaspool on lähedane rakkude sisemisele kontsentratsioonile. See hoiab ära rakkude enneaegse lagunemise, mis võib agregatsiooni ja degradatsiooni tõttu põhjustada madalamat DNA saagist. Puhvri muud komponendid aitavad samuti kaasa lahuse osmolaarsusele, kuid glükoos, mitteelektrolüüdiks olemine on hea valik, kuna see ei häiri lahuse puhvrit omadused.
Tris pH stabiilsuse jaoks
Tris on tris (hüdroksümetüül) aminometaani lühinimi, mis on väga tavaline pH-puhver. GTE puhvri korral lisatakse puhvrisse happesool (Tris-HCl) kontsentratsiooniga 25 mM. See hoiab lahuse pH peaaegu füsioloogilisel tasemel 8,0, mis on ideaalne pH plasmiidse DNA happelise hüdrolüüsi (lagunemise) ja teiste rakukomponentide soovimatute kõrvalreaktsioonide vältimiseks.
EDTA hoiab ära DNA lagunemise
EDTA ehk etüleendiamiintetraäädikhape seob või "kelaadib" metalliioone lahusest, takistades neil osaleda soovimatutes kõrvalreaktsioonides. GTE puhvris lisatakse EDTA kontsentratsiooniga 10 mM. Selle peamine eesmärk on puhvris vaba tsingi, magneesiumi ja kaltsiumi ümardamine, vältides seeläbi DNA lagunemist teatud metalle vajavates radades.
Mõned olulised näpunäited
Hoidke oma GTE puhver külmas ja valmistage seda väikestes kogustes, et vältida tahtmatute bakterite paljunemist selles. Suhkur ja kontrollitud pH annavad suurepärase kasvukeskkonna. Kasutage alati puhastatud vett. Kraanivees võib torudest olla liiga palju metalliioone, mis võib ületada EDTA võimet haarata. Kui kahtlustate, et proovis on häiriv RNA, lisage probleemi kõrvaldamiseks oma GTE puhvrisse RNaas A 100 mikrogrammi milliliitri kohta.